酮醇酸还原异构酶（KARI）,也被称为乙酰羟酸还原异构酶（AHIR）,是支链氨基酸生物合成途径中的关键酶之一。三种支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）均属于人体必需氨基酸,即人体自身无法合成,必须通过食物获取,而细菌、真菌以及植物等可以自行合成,故可将支链氨基酸生物合成途径中的关键酶作为筛选抗菌剂、除草剂的潜在靶标。因此对KARI酶学性质及酶催化反应中间体的研究具有十分重要的意义。KARI酶有两类,I型大约由340个氨基酸组成,结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）KARI属于该类;II型相较I型分子量大,约由490个氨基酸组成,该类KARI存在于包括大肠杆菌（Escherichia coli）在内的一些细菌和所有植物中。该酶可通过两步连续的反应将2-乙酰乳酸（AL）或2-乙酰-2-羟丁酸（AHB）转化为各自对应的产物2,3-二羟基羧酸,即2,3-二羟基-3-甲基丁酸及2,3-二羟基-3-甲基戊酸。本文以M.tuberculosis源和E.coli源的KARI为研究对象,首先对工程菌进行诱导表达,并采用亲和层析法纯化得到了浓度较高、纯度良好的EcKARI和MtKARI。由于KARI在催化反应过程中需要以NADPH为辅酶,因此可根据反应过程中NADPH的消耗检测酶的活性。活性测定结果显示经EcKARI或MtKARI催化后,底物的消耗率均达到了85%以上,表明所制备的两种KARI均有较高的催化活性。在此基础上,我们对两种KARI的酶学性质进行了分析,结果表明EcKARI和MtKARI的最适反应温度均为37℃,最适p H均为7.0;在金属离子依赖性方面,二者表现出了不同的特性,MtKARI仅在Mg2+参与催化反应条件下才能充分发挥其催化活性,而EcKARI除了可以利用Mg2+外,在Mn2+或Zn2+存在的条件下也显示出非常高的活性。同时,分别以AL和AHB为底物对两种KARI进行了稳态动力学参数的测定,其中以AL为底物的测定结果与文献报道值基本相符,以AHB为底物尚未见报道。本文测定结果为:1)EcKARI,Km,AHB=0.58 m M,Km,NADPH（AHB）=0.085 m M;2)MtKARI,Km,AHB=0.46 m M,Km,NADPH（AHB）=0.071 m M。KARI催化反应的产物为2,3-二羟基羧酸,此类物质没有生色基团,难以直接利用紫外或荧光检测器检测。本文拟将反应产物进行脱羧,再根据脱羧后化合物的理化性质采用柱前衍生-HPLC法或气相色谱法进行检测。本文对此方案进行了多种实验条件的尝试却没有得到理想的结果,这可能是由于2,3-二羟基羧酸难以在所设定的实验条件下有效脱羧,因此后期还需对实验条件进行优化。此外,3-羟基-3-甲基-2-丁酮酸（HMOB）被认为是KARI催化反应过程中的中间体,目前尚未有直接检出该中间体的报道。本文采用柱前衍生-HPLC法对HMOB的直接检测进行了初步探索,虽然仍未检测到该中间体,但我们对此进行了合理推测,即在KARI催化反应过程中,中间体HMOB与酶可能形成了紧密结合的复合体使得其很难游离出来。本文对EcKARI和MtKARI开展的一系列研究结果为后期深入分析KARI酶催化机制以及以该酶为靶点筛选抗菌先导化合物提供了参考。