本文以经典小复方四逆散为研究对象,以传统中医药理论为指导,选择方中最小配伍单位-“药对”为关联点,从全方-药对-单味药材-化学成分单体水平进行多层次地深入研究工作,探究四逆散的配伍机理和抗肝损伤药效物质基础。一、四逆散化学成分研究利用液质联用技术,测定四逆散中各单味药材、药对及全方的体外化学成分谱,共鉴定出31种化学成分。其中,芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸、柚皮素、柴胡皂苷a和甘草次酸通过与对照品对照进行确认,其他成分则通过分子量信息和二级质谱(MS/MS)信息加以确认。对比各单味药材、药对与四逆散全方的化学成分谱发现,四逆散在配伍过程中没有产生新成分。但芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸、柚皮素、柴胡皂苷a在四逆散中的含量均高于其在各单味药材中,且具有显著差异,7种化合物在其药对中的含量,与其在各单味药材中相比,也有不同程度地增加。四逆散体外化学成分的多层次研究为探讨四逆散的配伍机理,揭示四逆散的药效物质基础奠定基础。二、四逆散入血成分动态变化研究建立四逆散的含药血浆动态图谱,监测化学成分群在体内的实时、整体、动态变化情况。采用UPLC-MS/MS法研究了四逆散进入体内的活性成分及其代谢物谱。通过与对照品和文献中质谱数据对照,在含药血浆中共检测到23个入血成分,其中,芍药苷、甘草苷、异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸、芒柄花苷、柚皮素、柴胡皂苷a、川陈皮素和甘草次酸以原型方式入血,其余11个成分为代谢产物,初步推测出其中10个代谢物,分别为甘草素硫酸酯结合物、甘草素葡萄糖醛酸结合物、甘草素二氢还原硫酸酯结合物、柚皮素葡萄糖醛酸硫酸酯结合物、柚皮素葡萄糖醛酸结合物、橙皮素葡萄糖醛酸硫酸酯结合物、2个橙皮素葡萄糖醛酸结合物、橙皮素硫酸酯结合物和甘草次酸羟化物。研究不同时间点入血成分的动态变化情况,以考察中药化学成分在体内的动态变化规律。推测原型入血成分可能为四逆散的药效物质基础。三、四逆散抗肝损伤药效作用研究大鼠随机分为8组,即空白组、模型组、阳性对照组(30 mg/kg)、全方组(40 g/kg)、柴芍组(20g/kg)、柴枳组(20g/kg)、芍枳组(20g/kg)和芍甘组(20g/kg)灌胃给药(按10 mL/kg),同一时间每天1次,连续5天。末次给药2 h后,采用一次性腹腔注射40 %四氯化碳(3 mL/kg)所致急性肝损伤为药理模型,测定造模后24 h的大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红质(TB)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和肝匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量以及观察肝脏的病理学改变,考察四逆散及其4个药对抗肝损伤的药效作用机理。结果发现,四逆散及4个药对均有不同程度的抑制血清转氨酶升高,保护肝细胞和肝功能的作用,减轻肝组织损伤程度。柴胡和白芍配伍可较好地保护肝脏的排泄功能;白芍与甘草配伍可提高肝脏的合成蛋白质能力,增强机体清除氧自由基的过程,具有更强的抗氧化作用。四逆散全方抗肝损伤作用最全面,减轻肝组织损伤效果最佳,从药效学角度体现了其组方配伍的科学性和合理性。四、四逆散抗肝损伤谱效关系研究利用现代计算机信息技术将反映有效成分群的化学成分图谱与药效结果联系起来,建立谱效关系,结果芍药苷、柚皮苷、柴胡皂苷a和甘草次酸与药效相关性较大,作为四逆散抗肝损伤的药效物质基础。芍药苷、甘草酸、柴胡皂苷a和甘草次酸能显著降低肝损伤大鼠血清中ALT和AST的水平,保护肝细胞;柴胡皂苷a能显著降低肝损伤大鼠血清中TB的水平,具有保护肝脏的摄取、结合和排泄功能;甘草苷、甘草酸、芒柄花苷和甘草次酸能显著提高肝损伤大鼠血清中TP和肝匀浆中SOD和GSH-Px的含量,说明甘草中的成分可以增强细胞合成蛋白质的能力,提高清除自由基酶的活性,增强肝细胞抗氧化能力;枳实中的成分可以抑制MDA的升高,抑制脂质过氧化反应。五、四逆散抗肝损伤有效成分在大鼠体内的药动学研究在确定四逆散抗肝损伤药效物质的基础上,建立了 UPLC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中的芍药苷、柚皮苷、柚皮素和甘草次酸的浓度,血浆样品经乙腈沉淀蛋白,以甲醇和2 mmol/L 醋酸铵水溶液为流动相梯度洗脱,在Waters BEH C18 (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)色谱柱上进行分离,在ESI正离子模式下进行MRM扫描,定量下限分别为9.80 ng/mL (芍药苷)、5.10ng/mL (柚皮苷)、5.20ng/mL (柚皮素)、10.6ng/mL (甘草次酸)。方法的专属性、线性、日内日间精密度和准确度及稳定性均符合相关规定的要求。比较灌胃给予化合物单体、单味药材和四逆散全方后,四个有效成分在大鼠体内药动学行为的差异。实验结果提示,白芍和四逆散中的其他化学成分可能加速了芍药苷的吸收,促进了芍药苷向其代谢物的转化;四逆散中的其他成分促进了柚皮苷在大鼠体内的吸收及其向柚皮素的转化,枳实中的其他成分促进了柚皮素在大鼠体内的吸收;甘草中的其他成分可以促进甘草次酸的吸收或甘草酸向甘草次酸的转化;四逆散中的其他成分可能会进一步提高甘草酸的生物利用度及其向甘草次酸的转化。