研究背景与意义药对,又称对药,由两味药成对,个别由三味以上药组成,是临床上常用的相对固定的配伍形式。药对组成形式主要是在七情配伍的基础上,以一定证候特点及采用相应治法为前提,根据药物的性味归经、升降浮沉,选择性地将两味或两味以上的中药进行配对,其配伍蕴涵着丰富的客观规律。药对的配伍规律是基于中医药理论体系,能体现疾病证型、病机及药物特点而配合应用的药物间的联系,它是历代医家的经验总结,并经历了从感性认识到理性认识的飞跃,具有普遍性、重复性的特点。我们进行药对组成规律研究的意义：(1)进一步揭示药对配伍的客观规律与科学内涵,阐明药对配伍的物质基础与作用机理,在更广的范围、更深的层次展现中医治疗疾病的科学原理。(2)指导临床遣方用药,既能更有效地运用已有的药对,亦利于针对疾病谱的变化、病证的发展而创制新药对。(3)随着药对的作用机理与物质基础更加明确,在新药研究中以有效成分或有效部位配伍已越来越多,中西药配伍亦不鲜见,传统配伍的普遍规律同样可以指导新的配伍形式,对中药新产品制剂处方研创具有现实意义。本药对组成规律研究遵循中医药的“理法方药”诊疗理论,以伤寒论风寒表实证为主线,选择经方麻黄汤及其“君药对”麻黄-桂枝药对为研究对象,按性昧的“七情合和”配伍,以药味配比量为切入点,将药对配伍研究分解为：(1)药对配伍前后的体外化学成分变化研究。(2)主要药理效应(毒性)比较研究。(3)药对配伍对代谢组生物信息干预的研究。(4)运用解析多变量复杂关系的数理统计方法进行分析。通过麻黄桂枝药对配伍、化学成分变化、药理效应改变、体内代谢途径与机制几者间的内在联系,揭示药对的组成规律,据此为中医临床遣方用药、创制新药对及开发新药提供理论和实验依据。目的通过比较麻黄与桂枝不同配伍配比对水煎液中有效成分含量的影响,以探求麻黄与桂枝药对的化学变化规律。通过比较麻黄与桂枝不同配伍配比对急性毒性、解热作用及其定量分析的影响,探求麻黄桂枝药对化学成分与药效学之间的关系。通过比较麻黄与桂枝不同配伍对干酵母诱导大鼠热病症候的代谢组学研究,探求麻黄桂枝药对配伍前后调节机制。通过麻黄桂枝药对配伍、化学成分变化、药理效应改变、体内代谢途径与机制几者间的内在联系,阐明药对配伍的物质基础与作用机理,据此为中医临床遣方用药、创制新药对及开发新药提供理论和实验依据。方法1.以计算机检索、手工追溯检索等手段相结合,充分利用中国学术期刊全文数据库、PubMed、SieneeDireet、SpringerLINK、CA、Toxnet等数据库,广泛查阅有关麻黄汤、麻黄、桂枝及其有效成分的药理作用、毒副作用、生物转化、代谢和排泄的研究资料。2.麻黄桂枝药对不同配伍配比的体外化学成分研究分析在制备过程(体外)中化学成分数和量的变化,探讨麻黄、桂枝主要效应成分在制备过程中的理化变化和相互影响。《伤寒论》中麻黄汤组成为：“麻黄三两(去节),桂枝二两(去皮),甘草一两(炙),杏仁七十个(去皮尖)。”本实验选取麻黄汤中药对-麻黄桂枝(3：2)为研究对象,依据药对文献报道的配比上下成倍浮动,设计成三个配比,分别制备了麻黄、桂枝单味药水煎液、麻黄桂枝药对3：1、3：2、3：43个配伍配比水煎液、麻黄汤水煎液,分别采用GC-MS和HPLC测定麻黄中麻黄类生物碱(去甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱)和桂枝中香豆素、桂皮醇、桂皮醛的含量,比较麻黄与桂枝不同比例配伍前后水煎液中有效成分含量的变化。3.麻黄桂枝药对不同配伍配比的主要药理效应(主证)比较研究根据麻黄汤、麻黄、桂枝单味药及麻黄桂枝药对组合的现代相关研究结果,以毒副作用、解热作用、药物相互作用等相关指标,从药理效应相互关系方面分析药对配伍(偶合)对靶标效应强度的规律。结合药对配伍化学成分和急性毒性、解热作用结果进行回归,分析三者关系,探寻麻黄桂枝药对增效减毒的物质基础。急性毒性实验及相互作用研究取昆明小鼠,按照麻黄、桂枝、麻黄-桂枝(3：1)、麻黄-桂枝(3：2)、麻黄-桂枝(3：4)分为5个给药组,每组分别设5个剂量组。每组10只,雌雄各半。根据预实验确定的Dn、Dm,定出相邻两组剂量比,组间比值为1：0.8。一次灌胃给药不同浓度相同体积的受试药物(0.2ml/20g体重)。灌胃前禁食不禁水12小时,灌胃后观察饲养7d,观察小鼠的活动、饮食、腹泻、死亡、毛发光洁度等情况。记录各组动物中毒症状及死亡情况。记录实验结果,并计算LD50值和95%置信区间。急性毒性相互作用根据急性毒性实验所得数据采用中效法,运用软件Calcusyn对数据进行处理,合用指数CI<1为协同作用;CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用。解热药效实验研究采用干酵母混悬液诱导雄性SD大鼠发热模型,选取体温合格大鼠,随机分为正常对照组、模型对照组、阿司匹林组、安乃近组、麻黄组、桂枝(1)组、桂枝(2)组、桂枝(4)组、麻黄汤组、麻黄桂枝(3：1)组、麻黄桂枝(3：2)组、麻黄桂枝(3：4)组,每组8只,灌胃给药(正常对照组和模型对照组均给予等容积蒸馏水),给药后每小时测量肛温一次,连续测量三次。计算最大体温上升温度差(ΔT/℃)和3h抑制率(%)。解热药效相互作用实验研究根据解热药效实验所得数据,采用中效法,运用软件Calcusyn对数据进行处理,合用指数CI<1为协同作用；CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用。药对配伍化学成分和急性毒性、解热作用相关性研究根据化学成分分析和急性毒性、解热作用实验数据,运用SPSS16.0软件的线性回归(Linear Regression),选择逐步回归法(Stepwise)分析煎液中各有效成分含量与致死率、给药后3hΔT(℃)和抑制率(%)的线性关系。解热作用机制研究采用干酵母混悬液诱导雄性SD大鼠发热模型,选取体温合格大鼠,随机分为正常对照组、模型对照组、阿司匹林组、安乃近组、麻黄桂枝(3：2)低剂量组、麻黄桂枝(3：2)中剂量组、麻黄桂枝(3：2)高剂量组,给药后3h处死,取下丘脑,采用放射免疫法测定大鼠下丘脑中PGF2和cAM P含量的变化。4.麻黄桂枝药对不同配伍干预干酵母诱导热病症候的代谢组学研究根据风寒表实证的主要症状,选择比较接近的西医病的大鼠发热模型,随机分为5组,即空白对照组、模型组、麻黄组、桂枝组和麻黄桂枝3：2组,每组6只。各组于造模前收集8h尿液,除空白组外,大鼠背部皮下注射20%干酵母(10mL/kg大鼠体重)造模,各给药组分别在造模后6h、12h灌胃给予药液各一次,空白组和模型组给予同体积的蒸馏水。于造模后6h、10h、18h、24h、30h、36h各时间点分别收集尿液1次,即收集0-6h、6-10h、10-18h、18-24h、24-30h、30～36h共7个时间段的尿液,尿液直接衍生化。采用GC-MS联用技术测定各组大鼠尿液代谢物谱。运用XCMS工具箱对代谢物谱进行峰识别、峰对齐和峰面积归一化处理,得到由共有峰号、样品号及归一化峰面积组成的矩阵,将矩阵导入模式识别软件Simca-P12.0(瑞典,Umetrics AB, Umea)进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA),研究不同药对配伍干预干酵母诱导的热病症候代谢物组学的影响规律。对18～24h空白组、模型组、麻黄组、桂枝组和麻黄桂枝组的尿液代谢轮廓进行PLS-DA分析,对其特征抽提及模式识别。分析麻黄组、桂枝组、麻黄桂枝组生物标志物的差异及水平变化,结合现有的生物化学知识阐释麻黄桂枝药对配伍前后调节机制。5.统计学处理运用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组均数比较采用独立样本t检验；多组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),方差齐性采用LSD法；方差不齐,Welch法校正后采用Games-Howell法多重比较。所有检验水平α=0.05(双侧)。结果1.麻黄桂枝药对不同配伍配比的体外化学成分研究在已建立GC-MS色谱分析方法下进行了方法学考察,结果显示本方法结果准确,重现性良好,麻黄类五种生物碱分离度达到1.5以上,分离良好。在HPLC色谱条件下,香豆素、桂皮醇、桂皮醛分离良好,无杂质峰干扰,该方法快速、灵敏、准确。与麻黄单煎液相比,麻黄-桂枝配伍后,随着桂枝的配伍比例增大,水煎液中5种麻黄生物碱的含量均有不同程度的降低,其中麻黄桂枝(3：4)组五种生物碱含量均显著降低(P<0.001)。水煎液中去甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱含量由高到低依次为单味麻黄组>麻黄桂枝(3：1)组>麻黄桂枝(3：2)组>麻黄汤组>麻黄桂枝(3：4)组。与桂枝单煎液相比,麻黄-桂枝配伍后,水煎液中香豆素、桂皮醇、桂皮醛的含量均有不同程度的降低。2急性毒性实验麻黄组LD5o为140.708g·kg-1,95%可信区间为120.230～166.225g-kg-1；桂枝组LDso为137.988为g·kg-1,95%可信区间为117.902～163.006g·kg1；麻黄桂枝(3：1)组LD5o为140.774g·kg-1,95%可信区间为119.448～164.385g-kg-1；麻黄桂枝(3：2)组LDso为234.379g-kg’,95%可信区间为200.100-276.305g·kg-1；麻黄桂枝(3：4)组LD5o为223.342g·kg-’,95%可信区间为188.312～261.246g-kg-1。麻黄桂枝三个配伍组LD5o均大于单味麻黄和单味桂枝组,说明麻黄桂枝配伍后急性毒性比单味麻黄和单味桂枝小；3个配伍组比较,麻黄桂枝(3：2)组的毒性要略小于麻黄桂枝(3：1)剂量组和麻黄桂枝(3：4)组。急性毒性相互作用实验结果显示麻黄与桂枝三个配伍组急性毒性均具有拮抗作用,麻黄与桂枝三个配伍组的拮抗作用强弱大小为：麻黄桂枝(3：1)组>麻黄桂枝(3：2)组>麻黄桂枝(3：4)组。随着桂枝配伍比例的增大,急性毒性的拮抗作用增强。解热药效实验与模型组相比,给药2h后,各给药组均不同程度的抑制大鼠体温的升高。与单味药相比,麻黄桂枝配伍后三个比例组的解热作用均增强；在麻黄桂枝药对3个配比组中,麻黄桂枝(3：2)的解热作用最佳,效果与麻黄汤全方相当。解热相互作用实验麻黄-桂枝药对的相互作用采用中效法原理分析,运用软件Calcusyn对数据进行处理。麻黄、桂枝和麻黄桂枝(3：2)均表现出很好的量效关系。与模型组比较,麻黄-桂枝5个剂量均能显著抑制大鼠体温升高(P<0.01)。在相同剂量时,效应比较顺序为：麻黄桂枝(3：2)组>桂枝组>麻黄组；即麻黄、桂枝合用可使效应提高。麻黄桂枝(3：2)组合用指数CI<1,表明两者在酵母致大鼠发热后3h解热协同作用明确。药对配伍化学成分和急性毒性、解热作用相关性研究根据煎液中各有效成分含量和急性毒性、解热作用数据,运用SPSS16.0软件的线性回归(Linear Regression),选择逐步回归法(Stepwise)分析它们的线性关系,回归方程如下：致死率=-0.105+0.588E+0.165GPQ在被引入回归方程的有效成分中,麻黄碱和桂皮醛对致死率有显著影响(P<0.05)。由回归分析结果推断,麻黄碱和桂皮醛可能是麻黄桂枝药对产生毒性的物质基础。给药后3hΔ(℃)=1.953-12.213GPQ+29.196XDS抑制率(%)=26.596+459.205GPQ-1097.774XDS香豆素、桂皮醛对给药后3h AT(℃)和抑制率有显著影响(P<0.05)。由回归分析结果推断,香豆素、桂皮醛可能是麻黄桂枝药对解热作用的物质基础。解热作用机制与模型组比较,麻黄桂枝(3：2)低剂量组下丘脑中PGF2和cAMP的含量无显著性差异(P>0.05)；麻黄桂枝(3：2)中剂量组和高剂量组能明显抑制下丘脑中PGF2和(?)AMP的含量升高,差异具有显著性(P<0.05)。3麻黄桂枝药对不同配伍干预干酵母诱导热病症候的代谢组学研究3.1通过对模型组造模前后不同时间的大鼠尿液代谢物组进行PCA分析,绘制出反映组间离散程度的Score Plot,结果显示各组区分良好,不同时间模型组与空白组相比被分类,说明给予干酵母后大鼠正常生理代谢被干扰；模型组随着造模后所处时间段的不同,其代谢产物发生了一定的变化,不同时间模型组偏离正常组的程度明显不同,其中模型0-6h组,逐渐远离空白组,分类趋势越加明显,在18～24h达到最大值,表明该组代谢物谱变化最激烈；造模后30～36h,内源性产物的种类、浓度和相对比例在逐渐回调至空白组位置,但最终未能与空白组重叠,表明在观察时限内,模型组的物质代谢呈一定的自我调节趋势,但不能恢复至正常状态。3.2进一步对18～24h空白组、模型组、麻黄组、桂枝组、麻黄桂枝组共同进行PCA分析。从得分图上可见,在第一主成分方向,模型组与空白组区分明显,模型组位于第二象限,空白组位于第一象限,表明造模成功；给药组与同时间的模型组比较,区分明显,麻黄桂枝组位于第一象限,麻黄组位于第三象限,桂枝组位于第四象限,明显偏离模型组,表明3个给药组对干酵母诱导热病症候均起到了干预作用；3个给药组逐渐向空白组方向靠近,表明各给药组按模型组随时间的变化轨迹回归空白组；其中麻黄桂枝组和空白组位于第一象限,交叉重叠,难于完全区分。3.3对空白组、麻黄组、桂枝组、麻黄桂枝组与模型组分别行PLS-DA分析,获得了表征各给药组与模型组差异的生物标志物,包括有机酸、脂肪酸、氨基酸与胺类等。空白组与模型组行PLS-DA分析,获得了表征模型组与空白组差异的生物标志物,包括：水平高于空白组的正丙胺、丙酮酸、缬氨酸、苯甲酰胺、苯乙酸、苯丙氨酸、异丁酸、酪氨酸、色氨酸、异烟酰胺；水平低于空白组的丁二酸、辛二酸、柠檬酸、蛋氨酸、马尿酸、烟酰胺、异亮氨酸。麻黄组生物标志物包括：水平高于模型组的丁二酸、亮氨酸、酪胺、蛋氨酸、马尿酸、苯乙尿酸、精胺、异亮氨酸、环己基丙酸；水平低于模型组的正丙胺、缬氨酸、苯甲酰胺、庚二酸、焦谷氨酸、苯乙酸、己二酸、壬二酸、异丁酸、双羟苯乙酸、酪氨酸、5-羟色胺、色氨酸、异烟酰胺。桂枝组生物标志物包括：水平高于模型组的丁二酸、α-酮戊二酸、丝氨酸、辛二酸、蛋氨酸、马尿酸、苯乙尿酸、精胺、异亮氨酸；水平低于模型组的正丙胺、丙酮酸、缬氨酸、苯甲酰胺、苯乙酸、亮氨酸、月桂酸、壬二酸、、苯丙氨酸、异丁酸、谷胱甘肽、酪氨酸、色氨酸、异烟酰胺。麻黄桂枝组生物标志物包括：水平高于模型组的丁二酸、辛二酸、柠檬酸、马尿酸、半胱氨酸；水平低于模型组的正丙胺、丙酮酸、缬氨酸、苯乙酸、月桂酸、苯丙氨酸、2-甲苯基乙酸乙酯、谷胱甘肽、酪氨酸、色氨酸、异烟酰胺。3.4对空白组、麻黄组、桂枝组、麻黄桂枝组与模型组共同行PLS-DA分析,获得了表征各给药组与模型组差异的生物标志物,包括有机酸、脂肪酸、氨基酸与胺类等。空白组与模型组比较,生物标志物水平显著下调的有正丙胺、丙酮酸、苯甲酰胺、苯乙酸、亮氨酸、月桂酸、苯丙氨酸、异丁酸、酪氨酸、色氨酸、异烟酰胺：生物标志水平显著上调的有柠檬酸、马尿酸、异亮氨酸。麻黄组与模型组比较,生物标志物水平显著下调的有缬氨酸、苯甲酰胺、苯乙酸、异丁酸、酪氨酸、色氨酸、异烟酰胺;生物标志水平显著上调的有马尿酸。桂枝组与模型组比较,生物标志物水平显著下调的有戊二酸、缬氨酸、苯甲酰胺、苯乙酸、月桂酸、苯丙氨酸、异丁酸、酪氨酸、色氨酸、异烟酰胺；生物标志水平显著上调的有马尿酸、异亮氨酸。麻黄桂枝组与模型组比较,生物标志物水平显著下调的有正丙胺、丙酮酸、苯甲酰胺、苯乙酸、亮氨酸、月桂酸、辛二酸、苯丙氨酸、异丁酸、酪氨酸、色氨酸、异烟酰胺；生物标志水平显著上调的有柠檬酸、马尿酸。结论：1化学成分分析实验结果表明,麻黄与桂枝配伍后,麻黄中各有效成分的溶出率明显减少,其溶出率与桂枝在药对中所占的比例有关,比例越大,溶出率越小；麻黄与桂枝配伍后,桂枝中各有效成分的溶出率与桂枝单煎液相比也明显减少,随着桂枝的量增加,麻黄对桂枝的煎出量影响越大；麻黄桂枝配伍后对彼此有效成分的溶出有一定的抑制作用。推断二药配伍后,桂枝中有机酸和麻黄中生物碱之间可能发生了化学反应生成难溶于水的生物碱有机酸复盐,是导致配伍后水煎液中化学成分含量降低的主要原因。2药对配伍使用应从安全性和有效性两个方面考虑。结合急性毒性实验及相互作用研究、解热实验及相互作用研究的数据对麻黄桂枝药对不同配伍配比进行分析,与两药单独使用时相比,麻黄桂枝配伍使用后,毒性拮抗作用明确,解热药效实验有一定协同作用。其中麻黄桂枝(3：2)配伍的减毒增效作用十分明显。这与经方麻黄汤中麻黄和桂枝的配伍比例相吻合。进一步对煎液中各有效成分含量和急性毒性数据进行多元回归,分析它们的关系,由结果推断,麻黄碱和桂皮醛可能是麻黄桂枝药对产生毒性的物质基础,香豆素和桂皮醛可能是麻黄桂枝药对解热作用的物质基础。实验结果提示麻黄桂枝药对的药效物质基础不仅与药对中所含化学成分有关,而且与其所含化学成分的量比关系也有关,这与中药复方多成分、多靶点、多途径、多环节的作用机制相对应。318～24h各组对干酵母诱导热病症候大鼠尿液代谢标志物的影响空白组与模型组生物标志物的变化,表征干酵母诱导热病症候发生、发展的过程,一定程度上揭示了干酵母诱导的大鼠发热模型的生物学特征。根据尿液生物标志物的主要功能与代谢通路,与正常组相比,推断干酵母诱导大鼠发热模型组出现三羧酸循环障碍,无氧糖酵解增加,氨基酸过度消耗及脂肪酸代谢的紊乱。麻黄组、桂枝组、麻黄桂枝组对干酵母诱导大鼠发热模型尿液生物标志物水平呈现不同程度的回调,表明了3个给药组在一定程度上改善了干酵母诱导发热大鼠全身异常的代谢状态,通过整体调节机体的物质代谢、能量代谢与神经系统,其中麻黄桂枝药对配伍后生物标志物的回调程度最大,表明麻黄桂枝配伍使用干预干酵母诱导热病症候模型的疗效最佳。