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研究背景和目的：胶质瘤是颅内发病率、病死率最高的一种原发性中枢神经系统肿瘤，具有侵袭性生长的特性，术后复发率高，且多为致命性。虽然目前临床上采取手术、放疗、化疗、免疫等手段进行综合处理，胶质瘤的诊治已经取得了很大的进步，但是脑胶质瘤的总体治疗效果仍然非常差，其发病机制尚不明确，也缺乏特异性治疗药物。新近的研究表明针对某些细胞信号转导通路的分子靶点靶向治疗药物的研制是提高恶性肿瘤整体疗效的重要手段之一。Notch信号通路在中枢神经系统发育、神经胶质瘤的发生发展过程中发挥了关键作用，对胶质瘤细胞的生长、增殖、凋亡等过程起到决定作用，该途径的异常激活与包括胶质瘤在内的多种疾病的发生密切相关。细胞凋亡是机体为维持内环境的平衡进行的主动性细胞死亡过程，受一系列凋亡相关基因的调控。在此过程中Notch信号及其下游效应物发挥了重要作用，然而目前Notch信号途径的精确调控作用并未阐明，特别是Notch信号异常激活对肿瘤细胞增殖的影响，以及Notch信号异常活化后对下游靶基因及凋亡过程的作用并不明确。本实验通过体外培养人脑星形胶质母细胞瘤U87细胞株，并分别加入Notch信号激活剂rhNF-κB和抑制剂DAPT，观察rhNF-κB和DAPT对U87细胞增殖和凋亡过程的影响，初步探讨Notch信号系统在人脑胶质瘤U87细胞系增殖与凋亡过程中的调控作用及其可能机制，为分子水平治疗人脑胶质瘤、抗肿瘤药物的开发提供实验和理论依据。研究内容和方法：1、人脑星形胶质母细胞瘤U-87MG细胞株的培养：U87细胞在含10％FBS的培养基中培养传代，置于37℃、5％CO2潮湿的恒温箱中生长，取处于对数生长期的细胞进行实验。将细胞分成3组，分别为rhNF-κB组、DAPT组以及空白对照组，培养48h后收集细胞进行检测。2、Notch信号对U87细胞增殖和凋亡过程的影响台盼蓝染色法和MTT法测定rhNF-κBT和DAPT作用于U87细胞后对细胞增殖活性的影响，倒置相差显微镜下观察U87细胞的形态学变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率。3、Notch信号调控U87细胞增殖凋亡的机制RT-PCR检测各组U87细胞Notch1、Hes1、Bcl-2基因的表达，免疫荧光染色技术、Western Blot分别检测各组蛋白的表达，测量各自的总灰度值，定量比较分析各组蛋白相对灰度值。4、统计学处理所有数据均采用mean±SD表示，应用统计学软件SPSS19.0进行单因素方差分析，采用卡方检验进行统计学处理，P<0.05为具有统计学意义。结果：1、成功培养了人脑星形胶质母细胞瘤U-87MG细胞， RT-PCR法检测结果表明Notch1及Notch信号通路下游的靶基因Hes1在U87细胞株中均有表达，提示Notchl/Hesl信号通路在U87胶质瘤细胞中存在。2、Notch信号对U87细胞增殖和凋亡过程的影响MTT检测结果表明，培养24、48、72、96h后，rhNF-κB组细胞A值分别为0.185±0.007、0.398±0.012、0.735±0.015、1.083±0.031，DAPT组分别为0.102±0.003、0.130±0.004、0.161±0.006、0.194±0.003，对照组分别为0.167±0.005、0.265±0.008、0.496±0.011、0.737±0.016，与对照组相比，rhNF-κB组细胞有较高的活力，DAPT组和对照组的细胞活力较差，发生了不同程度的凋亡（P<0.05）。通过流式细胞仪检测发现，rhNF-κB组、DAPT组与对照组细胞的总凋亡率分别为0.96%±0.17%、26.51%±3.74%、8.76%±1.4%，与对照组相比，DAPT组细胞凋亡明显，而rhNF-κB组细胞凋亡较少，差异有显著性意义（P<0.05）。3、Notch信号调控U87细胞增殖凋亡的机制RT-PCR、免疫荧光、Western-blot检测rhNF-κB组、DAPT组与对照组细胞Notch1、Hes1、Bcl-2均有表达，其中Notch1mRNA及其蛋白表达量分别为0.974±0.110和0.910±0.082、0.263±0.054和0.302±0.09、0.642±0.072和0.578±0.101，Hes1mRNA及其蛋白表达量分别为0.833±0.106和0.896±0.145、0.241±0.047和0.423±0.090、0.402±0.088和0.696±0.115，Bcl-2mRNA及其蛋白表达量分别为0.230±0.075和0.726±0.113、0.098±0.024和0.252±0.064、0.151±0.052和0.503±0.092。与对照组相比，rhNF-κB诱导组细胞各组基因表达量增加，DAPT组表达较少。通过Western Blot检测，rhNF-κB诱导以后，Notch下游靶基因Hes1和抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显增多，DAPT组表达明显减少（P均<0.05），说明rhNF-κB能促使U87细胞逃避凋亡，DAPT则作用相反，促进细胞凋亡。结论：1、Notch1信号途径在人脑胶质瘤U87细胞中存在，在胶质瘤细胞增殖、存活过程中发挥重要作用，rhNF-κB诱导后激活Notch信号，DAPT诱导后抑制。2、Notch1信号在人脑胶质瘤U87细胞株增殖凋亡过程中发挥了重要的调控作用， rhNF-κB诱导后激活Notch信号，促进U87细胞增殖，逃避凋亡；DAPT诱导后抑制Notch信号，促进U87细胞凋亡，抑制增殖。3、Notch信号系统调控胶质瘤U87细胞增殖凋亡过程的可能机制：Notch1信号激活或抑制后通过Notch1/Hes1-Bcl-2通路调节靶基因Hes1、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达调控细胞的增殖凋亡。