药物筛选一般采用基于药物作用机制和基于作用药靶结构的筛选方式,利用细胞与动物模型,来确定作用效果和作用机制。随着高通量测序技术及基因芯片技术的大规模应用,以及合成化学高通量方法的普及,药物筛选进入了高通量时代,越来越多的新靶标和潜在靶点被发现,这些都得益于基因组数据库的完善和生物信息学自动化操作系统对数据库的分析。本研究利用不同细胞模型高通量转录组测序所得到的基因表达差异数据,采用生物信息分析方法结合基因-药物相互作用数据库和基因表达表型注释数据库,参照药物化合物数据库,筛选细胞模型相对应的基因特异性靶向化合物,利用细胞学方法对化合物干预细胞模型的效果进行验证,从而建立基于基因表达数据的目标化合物筛选和活性验证研究体系。本研究按不同细胞模型分为以下两部分。1.基于基因表达数据筛选具有促神经干细胞分化作用化合物的研究干细胞是一类具有自我复制和多向分化特点的细胞。以骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的研究已经成为干细胞研究的前沿领域。NSCs移植也是未来治疗神经系统疾病的重要方法。NSCs分化与其所处的细胞环境和细胞因子刺激关系密切,而NSCs特异性表达的基因对于其后续分化为神经细胞起关键性作用。因此,深入研究NSCs特异性表达基因及对其分化调节的作用,对于指导NSCs治疗神经系统疾病的临床应用具有重要意义。本研究以成人MSCs体外分离培养及诱导分化为NSCs的实验为基础,利用高通量测序技术对诱导前后细胞转录组进行检测,通过生物信息分析探明诱导过程中基因表达的变化,对差异表达基因进行聚类,利用基因-药物数据库及生物信息方法寻找关键基因的靶向干预化合物,进而进行化合物干预作用实验验证靶向化合物对神经干细胞分化的影响。(1)利用特殊培养基诱导MSCs向NSCs分化,细胞表面特异性抗原检测分化细胞具有NSCs表面标志,形态学观察显示其具备NSCs细胞特征。(2)利用高通量测序技术检测分化前后细胞转录组变化,通过数据分析,我们发现分化前后细胞全基因组共有3685个基因发生表达改变,其中与细胞发育相关基因共有254个,神经系统发育相关基因共有109个,细胞分化相关基因共有113个。(3)通过基因表达表型注释数据库及生物信息分析,发现分化前后差异表达基因主要集中在MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、Focal adhesion、Regulation of actin cytoskeleton、Neuroactive ligand-receptor等通路中,这几个通路为NSCs研究热点通路,反映NSCs向神经细胞分化过程的主要调控机制。(4)通过对NSCs特异性表达基因编码蛋白和关键通路内的蛋白进行ProteinProtein Interaction Network分析显示,特异性表达蛋白形成了以MAPK-JAK2-STAST-AGTR1-TSPO-PPARA为核心的蛋白相互作用网路,反映了该网络在NSCs分化调控中处于主导地位。通过与基因-药物数据库对应的生物信息分析,分化前后差异表达的3685个基因共有468个基因具有靶向匹配化合物,NSCs特异性表达和核心通路上具有靶向性药物对应的基因共有162个。经过文献检索和化合物数据库筛选,我们选取了TSPO基因特异性激活药物依替福辛(Etifoxine)进行NSCs分化干预实验,结果显示单独使用依替福辛对NSCs进一步分化为神经细胞具有促进作用(分化率12.482±0.018%,P<0.05),联合使用依替福辛+bFGF诱导有明显的促进作用(分化率38.096±0.040,P<0.05),说明依替福辛可以通过激活线粒体中的TSPO基因,促进NSCs向神经细胞分化。2.基于基因表达数据筛选具有抑制Dami细胞增殖作用化合物的研究白血病是一种造血细胞恶性增生性疾病,患者造血系统产生大量不成熟的白细胞,细胞失去周期调控。白血病临床治疗采用的造血干细胞移植技术可以使白血病有治愈的可能。但移植的成功率也只有50%左右,并且造血干细胞移植技术存在配型和捐献等方面的诸多问题,并不是所有患者都可以顺利进行移植,因此目前白血病的临床治疗仍以化疗为主。本研究利用前期建立的临床白血病患者外周血转录组测序数据,依靠基因-药物相互关系数据库和NCBI数据库,筛选候选药物氨磷汀,以Dami细胞系和骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)为实验对象,观察氨磷汀对人巨核细胞白血病Dami细胞系细胞和BMSCs生物学活性的影响,通过对氨磷汀干预Dami细胞系细胞前后基因表达变化和调控网络分析,探讨氨磷汀抑制Dami细胞系细胞增殖的机制。(1)通过数据库找到的药物氨磷汀(2-(3-氨基丙基)氨基乙基硫代膦酸酯),是一种用于治疗核辐射和化学武器伤害的广谱细胞保护剂。(2)体外细胞学实验证明氨磷汀对Dami细胞系细胞具有抑制其增殖,促进其凋亡的作用,而对BMSCs细胞影响不明显。氨磷汀可使Dami细胞系细胞增殖在G2期停止,细胞G0/G1期比例减少,从而表明磷汀可抑制Dami细胞系细胞增殖。3.对氨磷汀干预前后的Dami细胞系细胞进行全基因组表达差异检测发现,氨磷汀促使细胞CASP3基因表达上调和BCL2基因表达下调。4.对于差异最显著的1519个基因编码的蛋白,通过基因调控网络分析显示,特异性表达基因形成了以CCND1-PSMA2-ACAT2为核心的网络结构,这可能是氨磷汀抑制Dami细胞系细胞增殖的调控网络。