论文部分内容阅读
黑莓是一种新兴的第三代特色浆果,其营养丰富,富含花色苷、多酚化合物、维生素及多种矿物质,具有抗氧化、降血脂和抗心律失常等保健功效。黑莓酒作为黑莓汁酵母发酵的产物,最大限度的保留了其营养物质和功能性成分。果酒的香气和风味是多种挥发性化合物相互作用的结果,其中大部分风味化合物以无味的非挥发性糖苷形式存在。以β-D-葡萄糖苷酶为代表的糖苷酶能够水解这些糖苷香气前体释放出挥发性的糖苷配基,从而改善果酒的风味。目前,关于糖苷酶增香果酒的研究主要集中在酵母菌来源的β-D-葡萄糖苷酶对葡萄酒香气物质的影响。关于黑莓酒的香气的研究,仅涉及酿酒菌种的筛选、物理方式处理对其成分的影响。本研究从实验室菌种库中筛选出四株产β-D-葡萄糖苷酶且酶活性强的乳酸杆菌(Lactobacillus),并对其产酶部位进行了测定。由于酶活主要存在于细胞沉淀、菌株液态发酵不良等因素,不易获取大量天然β-D-葡萄糖苷酶。利用生物信息的高同源性,选取三个乳酸杆菌的β-D-葡萄糖苷酶基因进行分子克隆。通过生物工程技术获得了一个具有β-D-葡萄糖苷酶活性的重组酶Lb0241。在测定了其酶学特性的基础上,研究其对黑莓酒香气物质的影响。具体研究结果如下:1.产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选、鉴定及初步酶定位采用七叶苷显色平板法,方便快捷地筛选出4株高产β-D-葡萄糖苷酶的乳酸菌CM3、Hsb、FL12、T61。通过生理生化和16S rDNA试验,CM3鉴定为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、Hsb、FL12 鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和T61鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。通过酶的初步定位实验发现CM3、Hsb、FL12的完整细胞、破碎菌液、细胞沉淀才具有酶活,菌株T61在液体培养条件下发育不良,因而无法扩大培养。最终决定以这4株菌株为模板,通过分子克隆技术,获取同源的β-D-葡萄糖苷酶。2.重组β-D-葡萄糖苷酶的克隆、表达及纯化通过生物信息学同源比对,本研究选取多种已鉴定的乳酸杆菌源β-D-葡萄糖苷酶基因设计引物。从CM3、Hsb、FL12、T61基因组成功克隆得到三个β-D-葡萄糖苷酶基因,分别命名为LplaG、Lb0241、Lb367。将获得的基因片段插入到pET30a载体后,再将重组质粒导入大肠杆菌表达细胞BL21(DE3)中,并通过自诱导培养方式获取大量外源蛋白。通过SDS-凝胶电泳分析得知3种重组酶在大肠杆菌体系均能可溶性表达。但使用七叶苷显色平板检测重组酶的活性,发现只有重组酶Lb0241具有β-D-葡萄糖苷酶活性。用Ni2+-NTA亲和层析柱分离纯化该重组菌的表达产物,得到较纯的重组酶Lb0241。对其蛋白浓度进行测定,可知50 mL自诱导培养基可产生蛋白浓度为61.99 μg/mL的重组酶Lb0241。3.重组β-D-葡萄糖苷酶生化特性的测定以pNP-β-D-Glc为底物,对重组β-D-葡萄糖苷酶Lb0241的生化特性进行了探究,结果表明:重组酶Lb0241的最适反应pH为5.5;最适反应温度为30℃;重组酶Lb0241催化的反应均不需要金属离子作辅酶因子,其中Ni2+和K+能增强Lb0241的酶活性,而Fe3+、Fe2+和Mg2+抑制Lb0241的酶活性;五种化学试剂(包括尿素、SDS、咪唑、乙醇和β-巯基乙醇)均能抑制重组酶Lb0241的酶活性,其中SDS的抑制效果最明显,而Lb0241对乙醇的耐受性最佳;Lb0241 对pNP-β-D-Glc的Km值为0.84 mmol/L;Vmax;为0.693 mmol/L/min;Kcat值为0.018 s-1。以七种对硝基苯-糖苷(pNP-糖苷)为底物,用酶标仪实时监测重组酶Lb0241的催化反应。结果表明重组酶Lb0241能水解pNP-β-D-Glc 和 pNP-β-D-Gal。4.重组β-D-葡萄糖苷酶对黑莓酒香气物质的影响先采用固相萃取柱提取黑莓中的糖苷香气前体,再使用重组酶Lb0241分别处理黑莓的糖苷香气前体和黑莓酒。采用SPME-CG-MS技术检测、鉴定酶处理前后的挥发性物质。由分析结果可知:糖苷香气前体酶解处理后,可检测到的物质由9种增加到13种;黑莓酒经酶解后,可检测到的物质由17种增加到21种。虽然存在部分物质的减少,但酶处理后的香气种类总体高于未处理的样品,说明重组酶Lb0241具有显著的增香效果。