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第一部分:不稳定型心绞痛患者循环miR-146a-5p的临床意义目的:观察循环miR-146a-5p在不稳定型心绞痛(UA)患者和健康志愿者血浆中表达变化情况。方法:连续入选自2012年9月至2012年12月就诊于唐山工人医院心内科的近3个月未经他汀类药物治疗并行冠状动脉造影检查证实的UA患者23名。另选择28名年龄、性别、临床主要危险因素相匹配的并经冠状动脉造影证实冠脉正常的相对健康人群作为正常对照组。实时定量RT-PCR方法检测各受试者血浆miR-146a-5p循环水平,并应用受试者工作曲线(ROC曲线)分析血浆mi R-146a-5p水平变化对UA的临床诊断价值。结果:UA组患者主要临床特征,包括年龄、性别、吸烟、高血压病史、血脂水平较健康对照组均无显著差异(P>0.05)。以miR-423-5p为内参,应用Taqman荧光实时定量RT-PCR方法分别检测健康对照组和UA组受试者血浆mi R-146a-5p循环水平,结果显示UA组患者血浆mi R-146a循环水平,较健康对照组显著性下降,差异有统计学意义(P<0.0001)。通过ROC曲线分析,UA组miR-146a-5p曲线下面积(AUC)为0.997(95%CI,0.9886-1.005,P<0.0001),其高特异性和灵敏度度,提示miR-146a-5p循环水平对UA患者人群具有潜在的临床诊断应用价值。结论:在本实验中,相对健康对照组,mi R-146a-5p在UA患者血浆中的循环水平显著性下降,研究结果提示炎症及免疫调节相关miR-146-5p参与了UA的病理过程。其对UA患者人群的诊断、预后评价方面具有潜在的临床应用价值。目的:既往大量研究证实,细菌脂多糖和晚期糖基化终末产物均能刺激单核巨噬细胞炎症反应,成为触发和促进动脉粥样硬化进程的关键因子。同时,mirna-146a在细胞增殖、凋亡和分化所伴随的炎症反应调控中扮演重要的角色。然而mirna-146a是否参与细菌脂多糖和晚期糖基化终末产物诱导的thp-1源性巨噬细胞炎症反应却罕见报道。本研究的目的是观察体外pg-lps(以下简称lps)和age-bsa刺激条件下,巨噬细胞mir-146a-5p表达水平变化情况。方法:将不同孔细胞随机分为转染对照组,lps组,age组和mir-146a-5p转染组。lps与age组分别在加入相应浓度lps(1μg/ml)和age-bsa(100μg/ml),刺激pma诱导的thp-1巨噬细胞。应用荧光实时定量rt-pcr方法检测各组mir-146a-5p表达水平。结果:以mir-146a-5p转染组为阳性对照,以转染对照组为阴性对照,lps、age-bsa刺激pma诱导的thp-1巨噬细胞24h后,mir-146a-5p表达水平均被显著显著性上调,分别升高了约9倍(p<0.01)和2.3倍(p<0.05),差异有显著统计学意义。结论:内源性致炎性因子ages和外源性致炎性因子lps均能上调pma诱导的thp-1巨噬细胞mir-146a-5p的表达,提示mir-146a-5p在体内外致炎性因子的抗炎性反应中发挥着重要作用。第三部分:mirna-146a-5p负向调控lps和age诱导的thp-1巨噬细胞abca1、abcg1蛋白水平变化目的:胆固醇代谢途径关键蛋白abca1和abcg1在不稳定型心绞痛的病理进程中发挥着重要作用。而ua动脉粥样硬化性病灶的慢性炎症反应与胆固醇代谢调节途径的具体作用机制尚不明确。大量研究证实mirna-146a在细胞增殖、凋亡和分化所伴随的炎症反应调控中扮演重要的角色。然而mirna-146a是否能够调控由lps和age-bsa诱导的abca1/abcg1蛋白表达尚不清楚。本研究旨在是观察lps、age-bsa及mir-146a-5p对thp-1巨噬细胞abca1和abcg1蛋白表达变化的影响作用。方法:将不同孔细胞随机分为转染对照组,lps组,age组,mir-146a-5p转染组,lps+mir-146a组和age组+mir-146a组。含有lps第二部分:p.g-lps、age-bsa上调pma诱导thp-1巨噬细胞mirna-146a基因表达与age-bsa组于mir-146a-5p转染24h后分别加入相应浓度lps(1μg/ml)和age(100μg/ml),再持续刺激6h,采用westernblotting免疫印迹法检测各组abca1和abcg1蛋白表达水平。结果:同对照组相比,mir-146a-5p单独转染组pma诱导的thp-1巨噬细胞abca1、abcg1蛋白水平无明显变化(p>0.05);而lps组abca1、abcg1蛋白表达水平均被显著性上调(p<0.05);age-bsa组abca1、abcg1蛋白表达水平均被显著性下调(p<0.05)。与lps组相比较,lps+mir-146a共刺激组abca1和abcg1蛋白水平被显著性下调(p<0.05);而与age-bsa组相比较,age-mir-146a共刺激组abca1和abcg1蛋白水平均被显著性上调(p<0.05)。结论:内源性致炎性因子ages和外源性致炎性因子p.g-lps均能影响巨噬细胞胆固醇代谢关键调节蛋白abca1和abcg1的基因表达,但其作用截然相反;在非致炎性条件下,mir-146a-5p对巨噬细胞abca1和abcg1均无作用,然而体外模拟增加mir-146a-5p水平能够逆转致炎性因子所诱导的abca1和abcg1基因表达变化。为研究mirna、炎性反应、胆固醇代谢途径间的交互作用研究,提供了新的科学依据和思路。第四部分:mir-146a-5p通过靶向抑制irak-1调节巨噬细胞abca1、abcg1表达目的:从上述实验中我们观察到lps、age能够诱导thp-1源性巨噬细胞abca1、abcg1蛋白表达水平变化,且mirna-146a可以逆转该作用,但其可能机制尚未明确。本研究目的是观察lps,age-bsa和mirna-146a对炎性调节因子irak-1和胆固醇代谢关键调控因子lxrα/β蛋白表达水平的影响。方法:将不同孔细胞随机分为转染对照组,lps组,age组,mir-146a-5p转染组,lps+mir-146a组和age组+mir-146a组。含有lps与age-bsa组于mir-146a-5p转染24h后分别加入相应浓度lps(1μg/ml)和age(100μg/ml),再持续刺激6h,采用westernblotting免疫印迹法检测各组irak-1和lxrα/β蛋白表达水平。结果:与转染对照组相比较,单纯mir-146a-5p转染组irak-1蛋白水平显著性降低(0.44±0.05vs0.72±0.21,p<0.05);同对照组(0.72±0.21)相比,LPS组IRAK-1蛋白表达水平(1.04±0.24)显著性升高(P<0.05);而LPS+miR-146a共刺激组(0.66±0.24)较LPS组IRAK-1蛋白水平被显著性降低(P<0.05)。同对照组相比,AGE-BSA组IRAK-1蛋白表达水平被显著性升高(0.61±0.09 vs 0.49±0.02,P<0.05);同AGE-BSA组比较发现,AGE-BSA+miR-146a共刺激组IRAK-1水平被显著性减低(0.38±0.08 vs 0.61±0.09,P<0.01)。与对照组相比较,LPS和AGE-BSA组巨噬细胞LXRα/β蛋白表达水平均无显著性变化(P>0.05)。结论:在LPS或AGEs介导的巨噬细胞ABCA1和ABCG1上调或下调作用中,IRAK-1的蛋白水平均被显著性升高;体外模拟增加细胞内mi R-146a-5p水平后,抑制了LPS或AGEs介导的巨噬细胞IRAK-1的上调作用,说明miR-146a-5p能够靶向抑制LPS或AGEs介导的IRAK-1的上调作用。深入研究发现,miR-146a不仅靶向抑制了炎性因子诱导的IRAK-1的上调作用,同时也逆转了LPS或AGEs刺激条件下ABCA1和ABCG1的异常改变,提示miR-146a-5p可以通过负向调控靶基因IRAK-1表达,参与LPS和AGE-BSA诱导的胆固醇代谢途径的病理变化过程。