血小板减少症是一种临床上常见的疾病,但目前用于治疗此疾病的药物不仅种类少,而且还存在各种缺陷,临床上急需新型、高效的升血小板药物。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是巨核细胞-血小板系统最重要的调控因子和促进血小板生成最主要的细胞因子。TPO通过与其受体c-Mp1结合而刺激巨核细胞的增殖与分化,并促进血小板的生成和释放,控制循环血中血小板的数量和功能。但是,通过基因工程方法制备的聚乙二醇-重组人巨核细胞生长发育因子(PEG-rHUMGDF)在实际应用中,产生了中和性抗体,并与内源性TPO之间有交叉反应发生,导致血小板数量减少,而重组人促血小板生成素(rhTPO)在临床试验中也产生了诸多不良反应,美国FDA至今未批准人重组TPO基因工程产品进入临床。TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)是一种与天然TPO生物学活性相似但又与其完全不同源的短肽,体外实验显示TMP与巨核细胞表面的TPO受体c-Mp1具有很高的亲和力,体内动物实验未发现其能诱导产生中和性TPO抗体。但是由于TMP分子量非常小,不易通过基因工程方法进行制备,同时在血液中也容易被降解,因此使得它在临床上的推广应用受到很大限制。人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是人体血液中的主要蛋白,含量高达60%,它具有调节机体渗透压、均衡营养及促进伤口愈合的作用。由于它相对分子量较大(67000),且在机体内半衰期长,因此常被认为是延长小分子肽半衰期的理想工具,用于构建融合蛋白。在本研究中,我们通过基因重组技术,使用四个不同的连接肽将TMP-Linker-TMP-HSA克隆至pPinka-HC质粒中,最终成功构建了携带有TMP-HSA的四个不同的重组质粒,分别命名为 pPinka-13、14、15、16。为了获得TMP-HSA融合蛋白,本研究将上述重组质粒分别转化四种不同的蛋白酶缺陷型毕赤酵母菌株,对筛选获得的高拷贝子进行甲醇诱导表达,表达上清经SDS-PAGE及Western-blot的鉴定结果表明:构建的16株酵母菌株均能特异性分泌表达TMP-HSA融合蛋白,表达量最高达150μg/mL。在表达条件优化实验中,我们利用不同的甲醇浓度和不同的诱导温度分别表达目的蛋白,实验结果表明:在摇瓶小量表达的条件下,甲醇的最佳使用范围为4%～5%,诱导温度为30℃时表达量最高。实验表明,在毕赤酵母中分泌型表达TMP-HSA融合蛋白是可行的。