论文部分内容阅读
研究目的:神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是儿童中常见的一种肿瘤,可起源于交感神经系统的任意神经脊部位,原发于交感神经链和肾上腺髓质,也发生在颈部、胸部、腹部以及盆腔的神经组织等部位。NB具有治愈率低,易转移,病死率高,预后差等特点。目前NB的治疗主要以手术、化疗和放疗为主,但手术风险高,放化疗毒副作用大,且化疗容易产生耐药性,增加了其治疗的难度,严重威胁着儿童的身体健康,因此亟待寻找安全有效的新药治疗NB。近年来天然药物在临床中肿瘤的治疗和应用日趋增多,开发安全有效的天然抗肿瘤药物也成为研究的热点。2,3-吲哚醌(1 H-indole-2-3-dione,isatin)是一种天然产物,具有多种生物活性,其中抗肿瘤作用备受关注,但其作用机制尚不明确,需要不断地深入研究。2,3-吲哚醌存在于少量植物和人体体液中,是我国独创的具有自主知识产权的抗癌新药靛玉红的前体,其单体已可合成。2,3-吲哚醌也是一种具有抗肿瘤活性的单胺氧化酶抑制剂,分子量小,属于脂溶性物质,可以通过血脑屏障。2,3-吲哚醌以上的特性和结构优势,具有被开发为治疗神经系统肿瘤药物的潜力。本研究主要探讨2,3-吲哚醌对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖和侵袭迁移的作用及其可能的分子机制,旨在为2,3-吲哚醌开发为临床抗肿瘤药物奠定理论基础。研究方法:1.向神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中加入不同浓度的2,3-吲哚醌处理后,经不同的时间段后,CCK8实验检测细胞增殖能力的改变,确定2,3-吲哚醌发挥抗肿瘤的最适宜时间和浓度。2.神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y加入浓度梯度的2,3-吲哚醌进行预处理后,通过流式细胞术和DAPI染色实验检测SH-SY5Y细胞凋亡情况。通过流式细胞术检测加入浓度梯度2,3-吲哚醌处理SH-SY5Y细胞后,细胞周期的变化情况。3.通过Transwell和划痕实验检测不同浓度2,3-吲哚醌对SH-SY5Y细胞侵袭能力和迁移能力的影响。4.通过平板克隆实验检测不同浓度2,3-吲哚醌对SH-SY5Y细胞连续培养多天后细胞集落克隆形成的情况。5.qPCR和Western Blot实验检测p53、LSD1、SESN2、mTOR、LC3、P62、Beclin1基因的mRNA相对表达量和蛋白表达水平的变化,探讨2,3-吲哚醌对SH-SY5Y细胞增殖和侵袭迁移能力抑制作用的分子机制。研究结果:1.CCK8实验结果显示:向神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y加入不同浓度的2,3-吲哚醌处理后,与对照组相比,2,3-吲哚醌浓度越高,抑制率越大,且在处理48h后抑制效果最明显。2.流式细胞术和DAPI染色实验结果显示:随着2,3-吲哚醌浓度的增加,细胞凋亡增加,核凋亡现象明显。流式细胞术检测SH-SY5Y细胞周期的分布情况,结果显示:随着2,3-吲哚醌浓度的增加,SH-SY5Y细胞的G1期比例增加,S期所占比例减少,即发生了G1期周期阻滞,DNA复制受到了抑制。3.Transwell和划痕实验结果显示:对照组相比,2,3-吲哚醌处理SH-SY5Y细胞48h后,其侵袭能力和迁移能力明显减弱。4.平板克隆实验结果显示:与对照组相比,随着2,3-吲哚醌浓度的增加,实验组细胞克隆集落的形成明显减少。5.q-PCR和Western Blot结果显示:2,3-吲哚醌处理SH-SY5Y细胞后,2,3-吲哚醌浓度越高,LSD1、mTOR、P62 mRNA相对表达量和蛋白表达水平降低;SESN2、LC3、Beclin1的mRNA相对表达量和蛋白表达水平升高。p53、mTOR、P62、LC3、Beclin1的mRNA相对表达量和蛋白表达水平的改变说明2,3-吲哚醌处理SH-SY5Y细胞48 h后,诱导了自噬和凋亡,因此2,3-吲哚醌抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖和侵袭迁移的作用机制可能和自噬相关。研究结论:2,3-吲哚醌能够抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖,侵袭与迁移能力,并促进凋亡和自噬;其发挥作用的分子机制可能与抑制LSD1诱导SESN2-mTOR依赖的自噬信号通路有关。