自1993年第一个miRNA被发现以来，许许多多的miRNAs被陆续发现。虽然miRNAs不直接编码蛋白质，但却可以通过与靶miRNAs的非编码区3’端（3’UTR）结合，参与翻译调节过程。大量研究表明，miRNAs在人体各种细胞中均有丰富表达，并在人类肿瘤中存在异常表达，参与调节肿瘤发生发展的过程，如凋亡、增殖、细胞分化及转移等。应用肿瘤细胞系和各种肿瘤动物模型在功能机制方面的研究实验表明，miRNAs有肿瘤抑制基因、癌基因和调节肿瘤中信号通路的作用。MiRNAs在结直肠癌细胞系中的异常表达模式被许多文献报道，并且通过在细胞系深度测序、实时定量PCR、微阵检测等多种方法证实了这种异常表达的稳定性。MiRNAs在结直肠癌细胞系中的异常表达，表明miRNAs在结直肠癌发生过程中有着至关重要的作用。患者的临床分期或TNM分期、肿瘤局部侵润、淋巴转移或远端转移等因素决定了结直肠癌治疗策略的选择和对临床预后判断。手术切除及术后化疗是未发生转移的结直肠癌主要的治疗手段，但对于术前分期较高的患者来说，仍存在较高的复发几率。尽管低分化程度、高临床分级、淋巴管侵润等组织学因素可以预示肿瘤的高风险性，但可能影响肿瘤转移及复发的分子因素尚不明确。因此，我们需要找到稳定且有效的结直肠癌肿瘤标志物及药物作用靶点。可以通过对临床样本中异常表达的miRNAs进行筛选或研究miRNAs在人结直肠癌细胞系中作用机制两种途径，探究miRNAs在结直肠癌发生、发展过程中作用。而第一种应用临床样本的检测方法更为确切直接。癌组织和癌旁组织，外周血，粪便均为较常见的研究标本。在组织样本中检测miRNAs的表达量，对比结直肠癌组织和癌旁组织中的差异表达，可以帮助寻找潜在的肿瘤标志物。异常表达的miRNAs提示，其可能与肿瘤的发生发展，或患者肿瘤的某些临床特征有关。当检测到异常表达的miRNAs后，应在细胞实验中进行验证，并通过转染拟似物(mimics)、抑制物(inhibitor)或激动剂(agomir)、拮抗剂(antagomir)建立细胞或动物模型，进行上调或下调实验，检测细胞生物学行为的变化，推测其miRNAs的功能。再通过各种靶基因推测数据库，预测miRNA的靶基因mRNA，通过双荧光素酶报告分析等实验进行验证，揭示miRNAs可能调节的肿瘤信号通路。最后在肿瘤组织标本中再次进行验证，并与患者的临床信息进行分析，判断miRNAs与肿瘤大小、组织分化、淋巴结转移，脉管侵润，远端转移等的关系。对患者预后信息进行回访，与miRNAs表达量信息进行统计分析，判断其与肿瘤预后的关系。根据较早的几个微阵序列检测研究，发现miR-376a/-301b/-196b在结直肠癌中存在异常表达，但是并未经过深度测序或实时定量PCR进行验证。MiR-376a、miR-301b和miR-196b这三种miRNAs在其他肿瘤中的作用均有报道，提示其可能在恶性肿瘤中起着重要作用。如前列腺癌中miR-376a表达量与患者肿瘤的转移和预后有关；miR-301b促进胰腺癌细胞耐药；miR-196b在肺癌中的表达量有助于判断患者预后。本研究旨在通过实时定量PCR技术检测miR-376a/-301b/-196b在结直肠癌和癌旁正常组织中的表达，研究表达量与临床病理学因素及预后的关系。最终建立体外细胞模型研究三种miRNAs对结直肠癌细胞系的多种细胞生物学行为的影响，为结直肠癌的早期诊断、治疗提供新的方向，为新药物的开发提供新的靶点。1材料与方法1.1肿瘤样本收集及细胞培养共收集53例结直肠癌患者肿瘤组织及相应的癌旁正常结肠组织，培养结直肠癌细胞系SW480、SW116和HCT116。1.2病例信息收集收集53例患者的临床病理学信息，并对患者进行术后回访。1.3总RNA提取和实时定量PCR提取病理组织及细胞系中的总RNA，应用加尾法试剂盒进行miRNAs（miR-376a/-301b/-196b）的检测，U6为内参，计算相对表达量。1.4免疫组化检测对患者53例的石蜡切片标本进行脱蜡，抗体还原。检测其中各样本中VEGF的表达情况。1.5细胞转染应用Lipofectamine2000转染试剂将miR-376a与miR-301b相应的mimics和inhibitor,以及inhibitor control和mimics control转染结肠癌细胞株SW480，建立内源性miR-376a/miR-301b异常表达模型。实时定量PCR检测转染效果。1.6MTS实验使用CellTiter96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS）试剂检测内源性miR-376a/miR-301b异常表达模型的细胞增殖能力变化。1.7平板克隆形成实验应用低血清培养基，在6孔板中加入约500个转染细胞/孔，在孵育箱中培养14至21天，肉眼观察到细胞集落，终止培养，经染色后，观察细胞集落形成能力的差异。1.8划痕实验1.9数据分析用SPSS13.0软件进行统计分析，采用GraphPad Prism5软件制作数据图表。实验中应用了Wilcoxon matched pairs tests、2test或Fisher’s test、 log-rank test等统计方法。 Kaplan–Meier curves用来表示患者术后的生存状况，对于术后生存数据多因素统计分析设立了Cox proportional hazards model。以P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1肿瘤组织及癌旁组织、细胞系中三种miRNAs的表达量本实验应用实时荧光定量PCR方法检测了新鲜结肠癌组织、癌旁正常组织和结直肠癌细胞株microRNAs的表达情况。结果提示,miR-376a和miR-301b的表达显著下调（p<0.01），而miR-196b的表达量升高（无统计学意义）。MiR-376a和miR-301b在结直肠癌中表达存在异常表达，其异常表达可能与结肠癌的发生发展相关。2.2. MiR-376a、MiR--301b和MiR-196b与临床资料和患者预后的关系MiR-376a异常高表达，与患者淋巴结转移，及肿瘤组织中VEGF阳性表达具有相关性。且高miR-376a表达量是影响患者预后的独立因素。MiR-301b与患者临床因素和预后进行分析，未见统计学意义。MiR-196b表达量与肿瘤组织分化程度相关。2.3. MiR-376a、miR--301b转染对细胞生物行为的影响在对结肠癌细胞的生物学行为实验中发现，抑制miR-301b的表达可提高细胞活力，集落形成能力，加速划痕愈合，但上调miR-301b后，未见差异。上调miR-376a的表达能显著提高结肠癌细胞的增殖能力，集落形成能力和迁移能力；转染miR-376a inhibitor减低内源性miR-376a的表达，则抑制细胞的相应能力。进一步说明miR-376a与结肠癌的发生发展有关。3结论3.1MiR-376a高表达与淋巴结转移有关，影响肿瘤预后。3.2MiR-376a与结肠癌细胞的增殖、迁移有关。3.3MiR-196b表达量与肿瘤组织分化程度相关。3.4MiR-376a可以帮助结肠癌的诊断和预测术后生存状况。