棉花GbCO和GbMFT基因的克隆、表达和功能分析

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开花不仅是显花植物重要的生理现象,也作物的一个极其重要的性状,它影响农作物的生育期和生物量等进而影响产量和品质,一直以来备受关注。对植物开花途径中很多关键基因的克隆和功能分析,很好的揭示了植物开花的奥秘和分子机理。目的:以海岛棉新海14号为材料,进行开花相关基因的挖掘和功能分析,主要克隆棉花中光周期重要的调控基因之一CONSTANS (CO),棉花成花素基因FLOWERING LOCUS T (FT)的同源基因MOTHER OF FT AND TFL11(MFT1)和MFT2,进行基因表达分析,基因功能分析,将有助于揭示棉花开花调控的分子机制。方法:GbCO,GbMFT1和GbMFT2基因的克隆采用RT-PCR和RACE的方法;基因的表达采用半定量RT-PCR和quantitative Real-time RT-PCR (qRT-PCR)技术;构建植物过表达载体p35S:GbCO、p35S:GbMFT1、p35S:GbMFT2、p35S:GbMFT1-GFP和p35S:GbMFT2-GFP转化模式植物拟南芥和烟草分析基因的可能的功能。结果:(1)从新海14号花后9天的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO。GbCOcDNA的开放阅读框(ORF)为1008bp,编码335个氨基酸。序列分析表明GbCO和GhCO (GenBank登录号:HM006910)的相似性只有78.2%,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近。基因的表达分析表明,在棉花的根,茎,叶,花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高。并且在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1天和开花后5天的胚珠中表达量很高。受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天。(2)从新疆海岛棉品种新海14号中克隆得到了一个MFT类似基因,命名为GbMFT1基因(GenBank登录号:KC513744)。GbMFT1基因的ORF为528bp,编码一个包含175个氨基酸的蛋白,含有一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白Phosphatidylethanolamine-Binding proteins (PEBP)结构域。GbMFT1蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸。系统进化树分析表明GbMFT1编码产物与葡萄VvMFT、番茄SELF PRUNING2G (SP2G)亲缘关系较近,属于MFT-like家族的B亚家族。GbMFT1在棉花的不同组织中均有表达,但在花瓣中的表达量最高;在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后2d的胚珠、9d的纤维中表达量最高,在刚萌发的种子中表达量高,用不同浓度的ABA处理的种子中表达变化不明显,表明GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。过表达GbMFT1的烟草植株表现出提前开花的表型。亚细胞定位实验发现GbMFT1蛋白定位在细胞膜和细胞核上。(3)从新疆海岛棉品种新海14号中克隆得到了一个MFT类似基因,命名为GbMFT2基因。GbMFT2基因的ORF为519bp,编码一个包含172个氨基酸的蛋白,含有PEBP结构域。GbMFT2蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸。系统进化树分析表明GbMFT2编码产物与拟南芥AtMFT蛋白亲缘关系较近,属于属于MFT-like家族的A亚家族。GbMFT2在棉花的不同组织中表达较低,但在胚珠中的表达量最高;在胚珠发育的不同时期中均有表达,在开花后25d的胚珠表达量最高;GbMFT2基因的表达量会随着ABA浓度的上升而升高,且在高浓度的ABA处理下刚萌发的种子中的表达量高于已萌发的种子的表达量,表明GbMFT2基因的表达受ABA的调节。过表达GbMFT2的烟草植株表现出提前开花的表型。GbMFT2蛋白也是一个细胞膜和细胞核定位的蛋白。结论:GbCO和GbMFT1基因可能在海岛棉的开花发育中可能起着重要的作用。GbMFT2基因不仅在棉花开花发育中有起作用,还可能与棉花种子的发育相关。
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