论文部分内容阅读
“虫草”是广义虫草属(Cordyceps)真菌的总称。我国的虫草产业主要涉及自然资源较为匮乏的冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、蛹虫草(C.militaris)等真菌。其中,蛹虫草的成分、药理作用与冬虫夏草相似,尤其是CMPs-4多糖,具有重要的经济价值。由于蛹虫草能够人工培育,是解决野生虫草资源严重不足的有效手段;长期以来,一直是药用真菌研究领域的热点之一。我国新疆丰富的水稻、小麦资源,为蛹虫草的人工培育提供了充足的物质条件。菌种退化是制约蛹虫草人工培育技术发展的最突出问题。本文对蛹虫草的优质高产菌种选育和培养液配方优化开展了研究,旨在为蛹虫草的规模化生产提供理论和技术指导。同时,本文还对蛹虫草多糖CMPs-4对人工食道癌细胞Eca109的增殖抑制作用、及其对Eca109细胞周期和细胞凋亡的影响等问题进行了研究与讨论,以期揭示CMPs-4的抗癌机制。本论文首先从野生蛹虫草子实体中筛选了亲本菌株,在此基础上,培育子实体;利用单孢子分离技术分离单子囊孢子,并对其交配型进行鉴定;从不同交配型单子囊孢子菌株杂交产生的子实体中分离菌种,筛选出子实体产量较高的F1代杂交菌株。其次,结合新疆地区蛹虫草人工培育实际情况,在已有研究的基础上,针对不同培养基质分别进行了处理,以分析不同培养基质处理对蛹虫草子实体长度、鲜干重、生物转化率以及产量、产值效益等方面的影响,筛选适宜本地蛹虫草人工栽培的基质。最后,运用MTT法检测了蛹虫草多糖CMPs-4对人食道癌细胞增殖抑制作用;采用流式细胞术,检测了CMPs-4多糖对Eca109细胞周期以及细胞凋亡的影响,并利用扫描电镜观察了凋亡细胞的形态;在上述研究的基础上,采用Hoechst33258染色、Annexin V-FITC/PI双染法,检测了CMPs-4多糖对Eca109细胞凋亡的影响;最后,采用Western blot方法,对Bcl-2、Bax、caspase-8和caspase-3的表达进行了检测和分析。研究结果如下:(1)从亲本子实体中共获得10个菌株。10菌株通过人工培育形成子实体后,进行单孢子分离获得60株单子囊孢子菌株,其中37株单子囊孢子菌株可以成功扩增出鉴定交配型的目的产物。根据PCR分析结果显示,22株为MAT 1-1交配型,15株为MAT 1-2交配型。37单子囊孢子菌株只能扩增MAT1-2或MAT1-1中的一个,说明MAT1-1和MAT1-2不能共存,是一个非常明显的二极异配体系。相同交配型组合培养,其原基生长发育较慢,但亲和性较高。而MAT1-2和MAT1-1不同交配型杂交组合培养,原基发育较好,但亲和比较低,上述研究结果表明,营养亲和良好的不同交配型蛹虫草菌株更容易形成子实体。(2)筛选出15个不同交配型(MAT1-1和MAT1-2单孢子菌株)组合的菌株,即A2×B4、A2×B1、A2×A9、A2×A1、A5×B1、A5×A1、B3×B8、B3×B4、B3×B1、B9×B4、B9×A9、B9×A1、B11×B8、B11×B4、B11×B1,可为后续人工栽培提供优良的菌株组合。(3)通过对培育于不同基质的蛹虫草各项指标进行方差分析发现,各组间呈显著性差异(P<0.05),在100%大米培养基中的子实体产量更高(鲜重最高可达12.77g、干重可达2.05 g),生物转化率达到最高(可达60.54%),产投比最大(4.45),产值最高(2.05元/瓶),净利润最好(1.59元/瓶),其子实体生物产量比原来的栽培培养基所种植的提高33.7%。(4)蛹虫草多糖CMPs-4能够抑制人食道癌Eca 109细胞的增殖,诱导人食道癌Eca109细胞凋亡,其抑瘤效果对剂量和作用时间存在显著依赖。CMPs-4显著抑制了Eca-109细胞的生长增殖,当药物浓度从100μg/m L增加至1000μg/m L时,其生长抑制率从11.70%增加到66.54%,培养24 h的IC50值为532.9μg/m L。流式细胞术检测表明,位于S期的Eca109细胞的比例逐渐从32.23%增加到49.27%(P<0.05),即Eca109细胞在经过CMPs-4处理,被阻滞在S期,不能转化至G2/M期的细胞增多;同时,G0/G1期的细胞也无法进入到S期。受CMPs-4的抑制作用影响,Eca109的细胞凋亡率从3.12%上升到14.44%(P<0.05),电子显微镜下也能明显观察到细胞凋亡的形态学特征。CMPs-4处理Eca109细胞后,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显下调,促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8表达量上调。本研究筛选了优质蛹虫草菌株和适宜新疆地区的人工栽培基质,优化了蛹虫草培养体系,为在日光温室和现代化温室条件下、充分利用新疆地区丰富的小麦和水稻资源,规模化发展蛹虫草产业提供了科学依据和技术指导。本文还对蛹虫草CMPs-4多糖的抗肿瘤机制开展了研究,为进一步深入探究蛹虫草多糖抗肿瘤作用的分子机制提供了科学参考。