视网膜色素变性是一种遗传性疾病,临床和遗传异质性显著,鉴于本病的异质性,我们通过目标序列捕获测序对ADRP家系进行分子遗传学研究,寻找其致病基因及突变位点,旨在深入探究RP疾病的发病机理,为RP疾病的治疗奠定理论基础。本课题组成功证实SNRNP200p.S1087L是本研究ADRP家系的致病突变,我们用该家系患者的皮肤成纤维细胞成功诱导出iPS细胞,此iPS细胞经过一系列诱导可分化为视网膜色素上皮细胞。为治疗视网膜变性疾病和挽救视力打下实验基础。第一部分一个四代常染色体显性遗传视网膜色素变性家系的临床表型与基因筛查分析目的:研究中国一个四代常染色体显性遗传视网膜色素变性家系患者的致病基因筛查定位及临床表型方法:收集南京医科大学第一附属医院眼科门诊诊治的一个共有12名家庭成员参与研究的四代ADRP家系的临床资料,绘制家系图谱并分析其遗传方式,采集参与研究人员的外周静脉血10ml,完善眼科基本检查。本课题组前期已设计并订制了包含180个已知的IRDs致病基因及9个高度怀疑与视网膜疾病相关的剪切基因的目标序列捕获芯片(美国Roche公司),并完成了对该芯片有效性及捕获效率的检测。利用捕获芯片将该家系的先证者(Ⅳ:3)和患者(Ⅲ:10)的目标区域DNA片段富集并借助高通量二代测序平台进行捕获测序。所得数据进行生物信息学分析过滤,以便获得候选致病突变。结果:该家系四代共26名家庭成员,其中12名参与者的外周血被收集。7名患者在三代内均有分布,性别无显著统计学差异。符合常染色体显性遗传特性。通过目标序列捕获测序技术,并凭借生物信息学分析技术,证实该家系的致病基因及突变位点是SNRNP200 p.S1087L。该家系临床表型:发病年龄早,病情发展迅速,患者均有典型的夜盲症状和骨细胞色素沉着等视网膜色素变性的特征性眼底改变。结论:本研究进一步验证了 SNRNP200 p.S1087L为视网膜色素变性的热点突变之一,其相应的临床表型特点包括发病年龄早,病情发展迅速,视力和视野受损严重等。虽然目前该病尚无有效的治愈方法,但是致病基因位点的确定仍对后期研究治疗方法有一定的意义。第二部分 RP患者的特异性iPS细胞诱导及iPS-RPE细胞诱导分化的初步研究目的:通过利用致病突变位点为SNRNP200 p.S1087L的RP患者的皮肤成纤维细胞诱导分化为iPS细胞,并进一步诱导为RPE细胞。方法:1)采集基因突变点SNRNP200p.S1087L的RP患者的皮肤组织块,用胰酶消化传代,分离纯化得到成纤维细胞,2)利用逆转录病毒将4种基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)转入患者皮肤成纤维细胞(HDF)获得诱导多能干细胞(iPS细胞),3)培养iPS细胞,诱导分化为RPE细胞,4)通过细胞形态学、碱性磷酸酶染色、干细胞表面多潜能标志物染色对所得到的iPS细胞和iPS-RPE细胞进行鉴定。结果:1)成功从患者的皮肤组织中分离出成纤维细胞,并可以传代培养。2)成功诱导出患者的特异性iPS细胞并具有iPS细胞的生物活性,细胞形态类似于胚胎干细胞(ES)。3)iPS细胞碱性磷酸酶活性增高,表达ES细胞标志物(SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81及Nanog)。4)iPS细胞在体内能分化为具有三个胚层组织的畸胎瘤,在体外能分化为拟胚体。5)iPS细胞经诱导分化表现出RPE细胞样,经免疫荧光检测为RPE细胞,为RP的细胞治疗奠定基础。结论:基因突变点SNRNP200p.S1087L的RP患者特异性iPS细胞可以由其皮肤成纤维细胞诱导分化而得到,其特异性iPS细胞可以定向分化为RPE细胞。