研究背景及目的 天然生长抑素是14肽或28肽，广泛分布于人体神经内分泌系统和其它多种组织，对体内生长抑素受体的五种亚型都具有高的亲和力[1]。但由于其在体内的生物半衰期只有3分钟，因此不适宜临床应用。在过去的20余年中，研究者们人工合成了大量半衰期相对较长的生长抑素类似物，如奥曲肽、兰若肽等，用放射性核素标记后应用于临床进行生长抑素受体阳性肿瘤的诊断和治疗。但在研究及应用过程中，研究者们发现此类人工合成的生长抑素类似物仅对生长抑素受体亚型2和5具有高亲和力，对其它亚型无亲和力，从而使其在临床上的应用受到极大的限制。近年来，有学者将天然生长抑素与葡聚糖偶联，合成了对生长抑素受体五种亚型均保持高亲和力的糖基化生长抑素[2,3]，通过采用不同分子量的葡聚糖调节生长抑素的生物半衰期及体内分布[4,5]。这项研究受到了越来越多的关注，但是糖基化生长抑素与目前研究使用较广泛的生长抑素类似物-奥曲肽的竞争受体结合能力及体内生物学分布方面的对比研究尚不够深入。本课题采用分子量为10kD的葡聚糖和酪胶合成适于放射性碘标记的糖基化生长抑素(Tyramine-Dx10-SMS)，利用其与Tyr3-Octreotide竞争受体结合的方法，测定其对生长抑素受体的亲和力，并对所制备的125Ⅰ标记的糖基化生长抑素进行了正常SD大鼠体内分布、血液清除实验。本课题旨在深入阐明Tyramine-Dx10-SMS的生物学特性及体内分布状况，从而寻求一种比奥曲肽更好的，能够与生长抑素受体所有5种亚型都高亲和力结合的广谱型放射性标记物，为适用于所有生长抑素受体亚型阳性肿瘤显像诊断和治疗的广谱型放射性标记物的临床应用提供实验依据和理论基础，因此具有重要理论和实际意义。 实验方法 本实验用高碘酸钠将葡聚糖氧化，向活化的葡聚糖溶液中加入生长抑素和氰基硼氢化钠反应后，再向反应瓶中加入酪胺(Tyramine)继续反应，然后反应液经PD-10柱分离纯化，收集糖基化生长抑素产物(酪胺-葡聚糖-生长抑素，Tyramine-Dx10-SMS)。于分光光度仪测定糖基化生长抑素样品的吸光度，从而确定样品中生长抑素含量。 采用Iodogen法碘化标记糖基化生长抑素：将Iodogen涂于瓶底，分别加入磷酸缓冲液，Tyramine-Dx10-SMS溶液和Na125Ⅰ溶液，室温下反应。反应液经PD-10分离纯化，除去游离Na125Ⅰ，收集标记样品。室温条件下，将纯化的标记样品点样于快速薄层色层纸(ITLC-SG)，用放射性薄层扫描仪测量其放射性分布，并计算125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS的放化纯度。 自行制备SD大鼠大脑皮质细胞膜，经考马斯亮蓝法测定其蛋白浓度。利用竞争取代结合实验在体外测定Tyramine-Dx10-SMS的受体结合特性。按照课题设计，向试管中加入已稀释好的各种试剂：膜蛋白；放射配基125Ⅰ-Tyr3-Octreotide；浓度递增的竞争剂Tyramine-Dx10-SMS样品和Tyr3-Octreotide以及非特异组抑制剂Tyr3-Octreotide和反应缓冲液。反应管在水浴中保温，快速通过滤膜终止结合反应，于γ计数仪上测量其放射性。特异性结合等于总结合减去非特异性结合，每个剂量点重复3次，实验数据用GraphPadPrism4.0软件进行竞争结合分析，计算IC50值。另外以125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS与大鼠大脑皮质细胞膜SSR2行多点饱和结合实验。 取正常SD大鼠随机分组，每组3只。经尾静脉注射125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS，于注射后不同时间点断颈处死大鼠，取血及主要脏器，称重并测量其放射性，经衰变校正后计算每个脏器摄取的放射性占总注射剂量的百分数(％ID/g)。 实验结果 1.HPLC分析结果显示，合成的125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS无聚合体，化学纯度＞99％。 2.125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS的标记效率＞60％，放化纯＞98％，体外稳定，4℃下放置72小时放化纯无改变。 3.在受体竞争取代结合实验中，糖基化的生长抑素保持对生长抑素2型受体高的亲和力；其IC50值8.45nM与Tyr3-Octreotide(1.49nM)相近(同在低nM水平)。在饱和实验中室温14小时、37℃5小时未达到饱和坪区，SB/TB：最高61％，TB/Tcpm：最高1.42％。 4.125Ⅰ标记的糖基化生长抑素经尾静脉注射血液半衰期为6.7h，主要浓聚于肝、脾等并经肾排泄，肾上腺具有较高的放射性摄吸，24h内无明显变化。 结论 生长抑素的糖基化(125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS)延长了其血液半衰期，但是仍保持对生长抑素受体的高亲和力。生长抑素的糖基化后仍适合于125Ⅰ放射性标记。125Ⅰ标记的糖基化生长抑素在动物体内与葡聚糖的体内代谢途径一致，对生长抑素受体组织具有较强的靶向性。 本课题研究结果为进一步研制适用于所有生长抑素受体亚型阳性肿瘤显像诊断和治疗的广谱型放射性标记物提供了较坚实的实验依据，具有重要的理论和实际意义。