论文部分内容阅读
目的：结合临床及体内外基础研究探讨转录因子Sox4在宣威女性肺癌中的表达状态、生物学功能及分子作用机制。方法：1.宣威女性肺癌患者中转录因子Sox4的表达及临床意义研究：在通过免疫组织化学方法比较宣威地区女性肺癌(108例)、非宣威地区女性肺癌(94例)及肺良性病变组织(74例,其中宣威地区31例,非宣威地区43例)中Sox4蛋白表达的基础上,分别采集96例宣威女性肺癌患者的癌组织及远端正常肺组织进行液氮速冻及甲醛固定,应用实时荧光定量PCR及免疫组织化学技术检测样本中Sox4基因在mRNA及蛋白水平的表达,结合患者的临床病理特征及预后做Kaplan-Meier单因素生存分析及Cox多因素回归分析。2.抑制Sox4基因表达对宣威女性肺癌细胞XWLC-05生物学特性的影响及作用机制研究：利用实时定量PCR方法检测Sox4基因在不同类型肺癌细胞系、正常细胞系及胚胎细胞系中的相对表达水平；在化学合成的Sox4-siRNA有效沉默细胞中Sox4基因表达的基础上,采用基因重组技术构建靶向Sox4基因的shRNA重组质粒表达载体pGFP-V-RS-Sox4shRNA,以脂质体转染宣威女性肺癌细胞XWLC-05;利用透射电镜、MTS法、划痕实验、Transwell实验及流式细胞术检测Sox4基因表达抑制对细胞形态、增殖、迁移、转移及凋亡等生物学功能的影响；同时,采用"Rescue功能回复实验”验证RNA干扰的特异性；使用凋亡核心效应酶caspase-3的抑制剂Ac-DEVD-CHO处理Sox4基因抑制后的XWLC-05细胞,并检测细胞周期、凋亡率、caspase-3总量及活性等凋亡的相关指标,以深入探讨Sox4基因的分子作用机制。3.抑制Sox4基因表达对宣威女性肺癌裸鼠移植瘤的影响研究：将稳定转染了靶向Sox4基因干扰质粒pGFP-V-RS-Sox4shRNA的XWLC-05细胞接种于裸小鼠背部皮下,同时以接种稳定转染pGFP-V-RS-scramshRNA的XWLC-05(阴性对照组)细胞、未作任何处理的XWLC-05细胞及生理盐水的裸鼠作为对照,观测裸鼠一般情况、成瘤率、肿瘤生长和转移情况；接种后第25天处死裸鼠,测量离体肿瘤大小和肿瘤重量,计算肿瘤抑制率,并利用免疫组织化学技术检测移植瘤中Sox4、ki-67及caspase-3蛋白的表达。结果：1.宣威女性肺癌患者中转录因子Sox4的表达及临床意义研究：1)Sox4蛋白在女性肺癌组织中的表达显著高于在肺良性病变组织中的表达(P <0.05); Sox4在的宣威女性肺癌组织中的阳性表达率为52.7%,在非宣威女性肺癌组织中的阳性表达率为51.0%,两者间比较差异无统计学意义(P>0.05),表达水平间比较也无明显差异(P>0.05)；但在宣威和非宣威地区女性肺癌的各病理类型间Sox4蛋白的表达存在显著性差异(宣威地区F=24.529,P=0.017；非宣威地区F=26.461,P=0.009),既Sox4蛋白在小细胞肺癌中的表达水平显著低于在非小细胞肺癌中的表达(宣威地区F=7.657,P=0.049；非宣威地区F=9.423,P=0.037)；在非小细胞肺癌中,Sox4蛋白在肺腺癌中的表达水平显著高于在其他类型肺癌中的表达(宣威地区F=18.510,P=0.000：非宣威地区F=19.518,P=0.000)。2)宣威女性肺癌患者肿瘤组织及远端正常肺组织中Sox4mRNA的表达水平分别为2.53±0.35和1.43±0.18,差异有统计学意义(P=0.003)；免疫组织化学检测显示Sox4蛋白主要表达于细胞核,在肺癌组织中的阳性表达率53.1%(51/96)显著高于在远端正常肺组织中的阳性表达率26.0%(25/96),(P=0.000)；Sox4蛋白在不同临床分期(P=0.000)、淋巴结转移与否(P=0.000)、不同组织学类型(P=0.004)及肿瘤不同分化程度(P=0.002)患者中的表达差异有统计学意义；Kaplan-Meier生存分析显示：Sox4蛋白阳性和阴性表达组的中位生存期分别为26个月和39个月(P=0.000),有淋巴结转移患者的中位生存期短于无淋巴结转移的患者(P=-0.012),进展期患者的中位生存期短于早期患者(P=0.000)；多因素Cox风险回归模型显示：病理分期为宣威女性肺癌预后判断的独立影响因素。2.抑制Sox4基因表达对宣威女性肺癌细胞XWLC-05生物学特性的影响及作用机制研究：Sox4基因在各类型肺癌细胞系中的表达水平高于在正常细胞系中的表达(P<0.05),尤其在肺腺癌细胞系中的表达相对较高(P<0.05)；化学合成的Sox4siRNA可有效抑制XWLC-05细胞中Sox4基因的表达并诱导细胞的凋亡(P<0.05),但对细胞的增殖无明显影响(P>0.05)；成功构建了能高效抑制Sox4基因表达的pGFP-V-RS-A-Sox4shRNA重组质粒表达载体；重组质粒转染宣威女性肺癌细胞后,在抑制Sox4基因表达的同时上调了细胞中caspase-3的表达；抑制Sox4基因的表达后细胞出现凋亡形态学改变,细胞的增殖、迁移及转移能力较对照组明显减低,差异有统计学意义(P<0.01); FCM检测显示抑制Sox4基因的表达后细胞出现明显的亚二倍体峰,凋亡率高于对照组细胞(P<0.01)；RNA干扰回复实验(rescue control)排除了RNAi中的脱靶效应,反向验证了Sox4基因表达抑制对宣威女性肺癌细胞生物学功能的影响；caspase-3抑制剂使Sox4基因表达抑制的细胞中caspase-3活性片段明显减少(P<0.01),并显著降低了细胞的凋亡率(P<0.01)。3.抑制Sox4基因表达对宣威女性肺癌裸鼠移植瘤的影响研究：除生理盐水组外,接种宣威女性肺癌细胞的裸鼠成瘤率为100%；最早于接种后第6天出现肉眼可见的肿瘤；与对照组相比,抑制Sox4基因表达后裸鼠移植瘤的增长趋势明显受到抑制,离体瘤重及离体肿瘤的体积也显著低于对照组(P<0.01),肿瘤抑制率明显增高(P<0.01)；免疫组织化学染色显示：Sox4、caspase-3和ki-67蛋白均表达于细胞核,其中Sox4和ki-67在实验组细胞中的表达显著低于阴性和空白对照组(P<0.05),而caspase-3的表达组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。影像学和病理学检查显示,成瘤小鼠在实验期内均未观察到肿瘤的远处转移。结论：1.宣威女性肺癌组织中存在Sox4基因在转录和翻译水平的异常表达升高。2.转录因子Sox4的表达水平结合临床分期对宣威女性肺癌患者病情评估及预后判断有一定的指导意义。3.转录因子Sox4可能通过提高细胞的增殖能力及抑制caspase-3依赖的凋亡途径而促进宣威女性肺癌的演变和进展。