印楝素调控黑腹果蝇复眼发育相关凋亡基因的研究

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印楝素具有显著的昆虫生长发育抑制活性,研究其对昆虫特异性组织发育的作用机制可为创制新型昆虫生长发育调节剂提供新型作用靶标。本文从细胞凋亡调控角度研究了印楝素诱导黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)复眼生长发育异常的作用机理,明确了印楝素处理对复眼发育中凋亡相关的关键酶和基因的作用规律,论文结果为研究阐明印楝素等植物源杀虫剂调节复眼等昆虫特异性组织的生长发育的分子机制,发现新型作用靶标,创制新农药提供参考。  运用扫描电镜技术,观察了印楝素处理前后果蝇3龄幼虫末期眼原基及成虫复眼的形态学变化,结果显示印楝素4 mg/kg处理后,幼虫眼原基盘体萎缩、发育不良、无明显型态发育沟、组织细薄,光滑无纹理。成虫复眼形状不规则、表面皱褶凹陷、单眼刚毛排列杂乱并大量缺失。  结合透射电镜、免疫荧光染色技术,从微观形态学上确证了印楝素对黑腹果蝇复眼光感受细胞发育的影响。透射电镜结果显示:印楝素4 mg/kg处理后,成虫复眼内部结构的异常、小眼疏密不一、大小差异显著、感光细胞大量丢失。荧光染色显示,印楝素处理后,幼虫眼原基己分化的光感受细胞排列混乱、疏密不一、大小相异,有的光感受细胞丢失或产生巨型光感受细胞。  运用了吖啶橙(Acridine orange,AO)荧光染色和TUNEL(TdT-mediated dUTP nickend labeling)检测法,检测了印楝素对果蝇3龄幼虫末期眼原基的凋亡诱导作用。AO染色后,印楝素处理组幼虫眼原基出现大量致密浓染的绿色颗粒状着色点;TUNEL标记后,印楝素处理组幼虫眼原基产生大量分布不均的的绿色荧光着色点;结果表明印楝素诱导后,眼原基产生明显的DNA断裂这一细胞凋亡典型特征。  采用酶学测定方法研究了印楝素对果蝇3龄幼虫末期至老熟蛹阶段复复眼组织Caspase-3酶活性影响,结果表明各个龄期复眼组织均表现出一定的Caspase酶活性,其中,中蛹期最高、3龄末期次之、老熟蛹期最低。印楝素处理后,能够显著上调果蝇复眼组织各个龄期的Caspase-3酶活性,但并不改变各龄期的Caspase-3酶活力变化趋势,表明印楝素诱导凋亡作用通过Caspase-3途径进行。  运用实时定量PCR技术检测了印楝素处理前后果蝇复眼发育9个阶段中促凋亡基因相关mRNA表达量变化,并使用免疫荧光染色技术进一步研究这两个基因的促凋亡因子的表达分布。结果表明,印楝素能正调控rpr、hid两个促凋亡基因在果蝇复眼组织中的表达,以4 mg/kg处理后,rpr基因mRNA的表达量在预蛹期显著上升,hid基因表达量在3龄幼虫末期急剧上升,为CK的6倍。  免疫荧光染色显示,印楝素处理后,眼原基形态不能维持,畸形部位可见明亮分布不均的被红色荧光标记的rpr因子着色点,而hid因子标记局部染色浓淡不一、呈现不规则的红色染色条带。结果表明印楝素能影响这两个促凋亡因子的特异表达,推测从而显著影响复眼发育。  综合全文结果,本文认为印楝素能够促进黑腹果蝇复眼组织的rpr、hid基因mRNA及rpr、hid因子过表达,激活Caspase酶原,诱导果蝇眼原基发育相关细胞过度凋亡,小眼在发育过程中因过凋亡而无法正常重新排列,致使印楝素处理后,黑腹果蝇复眼组织表现出一系列的畸形、小眼、刚毛缺失、小眼排列异常、形态不能维持等异常显型。
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