论文部分内容阅读
蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）是原始的无脊椎变温动物,其干燥全体是一种重要的中药,蚂蟥目前在中国被广泛养殖。研究发现,蚂蟥冬眠一般从11月开始,持续到来年4月,当环境温度上升到在一定高度时就会自然苏醒,但冬眠时期的体重下降和长时间的持续冬眠严重影响蚂蟥的养殖生产效率。冬眠是动物为了在低温下长期生存产生的节能策略的自适应机制。在恒温和变温动物中都存在,其特征是低体温下抑制代谢节省能量。冬眠期间动物为了长期生存必需具备两个条件:首先,代谢和生理的调整必须支持组织或生物体的代谢需求使用和备用。第二,冬眠的生存需要特定的变化,避免和延迟细胞死亡在进入冬眠抑制状态和从冬眠苏醒的代谢旺盛状态。与恒温动物冬眠,变温动物冬眠不存在间歇觉醒,在此期间动物会产热几个小时内来维持正常体温。蚂蟥冬眠基础研究有限,本研究在对蚂蟥冬眠期间能量代谢和自我保护机制探索的基础上,通过TMT标记技术,对蚂蟥肠道差异蛋白质与差异蛋白磷酸化在蚂蟥冬眠前后的表达变化进行比较。本论文主要由四部分组成,分别为:1.冬眠动物的一个显著特征就是能量代谢被抑制,且这种抑制在动物从冬眠中苏醒时被迅速解除。本研究通过检测蚂蟥冬眠期间5个不同时期肠道能量代谢的关键酶酶活性和表达量以及能量代谢中关键物质的含量变化,发现蚂蟥冬眠期间不同时期能量代谢差异显著。实验结果表明:蚂蟥深冬眠期间糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化过程的关键酶（HK、PK、PDH、IDH、SDH、MDH、UQCR和COX）的酶活性和表达量显著下降,同时ATP、AMP、ADP、NAD+和NADH含量降低。在蚂蟥出冬眠苏醒时,糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化过程的关健酶酶活性和表达量同时升高,ATP、AMP、ADP、NAD+和NADH含量上升。结果表明,蚂蟥冬眠时能量代谢过程（糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化过程）显著下降,降低ATP的产量,出冬眠时能量代谢则迅速恢复,提高ATP的产量。蚂蟥具有一套严格完善的冬眠调控体系,确保各时期能量代谢的供应。2.根据蚂蟥冬眠期间5个不同时期肠道抗氧化酶活性和表达量的检测结果发现深冬眠期间蚂蟥由于生理活动受抑制,抗氧化能力也下降（酶活性和表达量下降）;入冬眠时由于受到低温的胁迫,抗氧化能力上升;出冬眠时受活性氧胁迫,抗氧化能力上升。这些结果说明蚂蟥冬眠期间不同阶段有不同抗氧化体系。通过测定Caspase3和Caspase8的酶活性和表达量,结合凋亡诱导因子AIF1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,发现蚂蟥冬眠期间肠道组织细胞凋亡受到抑制,出冬眠和入冬眠过程中,细胞凋亡升高。本实验还通过比较蚂蟥冬眠不同时期的热休克蛋白的表达量,探索热休克蛋白在蚂蟥冬眠过程中的变化规律。本研究中,蚂蟥深冬眠时期肠道HSP27、HSP60和HSP70的表达量较正常时期显著上升。入冬眠时,三种热休克蛋白表达量上升;出冬眠时,三者表达量显著高于正常时期,其中HSP27出冬眠时期显著高于其他时期。3.本研究运用TMT和LC MS/MS技术,定性和定量检测了蚂蟥冬眠期间的差异蛋白,揭示蚂蟥冬眠适应机制。实验结果表明:在三个组别中（活跃期、深冬眠期和苏醒初期）定性检测到3580个蛋白,定量检测到2184个蛋白,其中390个有显著差异。通过生物信息学分析,深冬眠时与脂肪分解相关蛋白升高,与糖类和蛋白分解蛋白下降,说明冬眠期间蚂蟥脂肪代谢上升,糖和蛋白分解被抑制。除此之外,蛋白合成、能量代谢、跨膜运输相关蛋白在深度冬眠时显著下调,而细胞骨架蛋白和热休克蛋白相关蛋白上升。我们推测蚂蟥在冬眠期间可能通过减弱跨膜运输和蛋白合成降低能量需求,增加细胞骨架蛋白重组细胞骨架维持细胞结构稳定来保护肠道细胞。4.本研究运用TMT标记和LC-MS/MS定量技术,分析了蚂蟥冬眠前后蛋白磷酸化变化规律。实验结果显示:在三个组别中（活跃期、深冬眠期和苏醒初期）定性检测2596个蛋白上有3474个磷酸化位点,其中定量检测到1388个蛋白上有2598个磷酸化位点。不同的磷酸化蛋白构成了蚂蟥蛋白磷酸化互作图,涉及信号转导、能量代谢、蛋白质合成、细胞保护等,这些过程多参与蚂蟥冬眠过程组织的自我保护。对相关蛋白活性检测证实了磷酸化变化对这些蛋白活性的调控。这些可逆的蛋白磷酸化变化通磷酸化级联反应调控下游蛋白活性,从而调控不同生理活动来适应冬眠不同阶段的环境。综上所述,对蚂蟥冬眠期间能量代谢和自我保护方面的研究可以发现,深冬眠期蚂蟥肠道能量代谢受到明显抑制,此时抗氧化能力也下降,但热休克蛋白表达量上升;入冬眠时,由于受到低温胁迫,抗氧化能力和热休克蛋白上升;苏醒时,由于能量代谢的迅速上升,抗氧化能力和热休克蛋白同样升高。通过对蚂蟥冬眠前后的差异蛋白表达及蛋白磷酸化水平整体比较,发现差异蛋白和磷酸化蛋白都涉及能量产生、蛋白合成、转录和翻译、抗应激、细胞稳态维持等,这些过程与能量代谢和细胞自我保护相关,进一步表明蚂蟥冬眠期间具有调节能量代谢和细胞自我保护机制来适应冬眠时期恶劣环境的能力。