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研究背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是免疫介导的一类以消化道炎症为主要表现的系统性疾病,主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病[1]。其致病机制仍不明确,多种因素均与其密切相关:包括遗传因素、肠道菌群、粘膜屏障及稳态、原始及获得性免疫、自噬等[2]。目前所公认的致病机制为:在遗传易感性人群中,免疫系统对肠道共生菌群产生异常免疫反应而导致的肠道炎症反应,即免疫系统异常是IBD发病的关键节点和最终通路。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一类具有自我更新和多向分化能力的干细胞,在再生医学领域及自身免疫性疾病的治疗等方面占重要地位。其来源包括成体组织、脐带脐血、也可从胚胎干细胞诱导而来[3]。MSC多共同表达某些表面分子,并在合适的外界刺激诱导下,能够分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞[4]。MSC具有强大的免疫调节能力,对各型T淋巴细胞均有调节作用[5-6],对抗原提呈细胞也有一定影响,能够使其表型改变,抑制其抗原提呈、趋化因子分泌、迁移等能力。由于异常免疫反应在IBD发病机制中占中心地位,而MSC具有良好的免疫调节能力,因此MSC对IBD的治疗一直是研究的热点和重点。其中,胚胎来源的间充质干细胞在一些动物疾病模型中体现出优于其它间充质干细胞的治疗效果[7],而它对炎症性肠病的治疗效果及机制研究仍十分匮乏。因此,本课题对胚胎来源的间充质干细胞治疗炎症性肠病的疗效和机制进行了初步探究。研究方法1.人胚胎来源间充质干细胞的诱导及鉴定(1)本实验采用ESI-053人胚胎干细胞,在培养基中加入骨形成蛋白-4刺激后进行培养,5天后传代可获得人胚胎来源间充质干细胞。(2)对3种基本表面标记物(CD73、CD90、CD 105)进行染色,流式细胞仪检测其表达。2.人胚胎来源间充质干细胞动物性抗原检测及免疫调节功能评估(1)N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)存在于绝大多数哺乳动物细胞表面,而人源性细胞不表达此类抗原。本研究通过对不同培养条件下的人胚胎来源间充质干细胞进行Neu5Gc染色,流式细胞术检测该抗原表达。(2)将胚胎来源间充质干细胞与人髓性白血病细胞系(K562)分别与人NK细胞共同培养,流式细胞术检测7-AAD,了解其对NK-T细胞杀伤的逃避能力。(3)人胚胎来源间充质干细胞与人T淋巴细胞进行共培养,BrdU染色测定人T淋巴细胞的增殖情况。3.人胚胎来源间充质干细胞对硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate sodium,DSS)结肠炎小鼠治疗模型建立及体内示踪研究(1)将C57BL/6小鼠分为4组:对照组(尾静脉注射DPBS/10u肝素钠),人胚胎来源间充质干细胞静脉组(尾静脉注射1×106间充质干细胞),人胚胎来源间充质干细胞腹腔组(腹腔注射1×106间充质干细胞),人脐带间充质干细胞治疗组(尾静脉注射1×106人脐带间充质干细胞)。(2)对照组及3个治疗组2%DSS饮水5天,正常饮水4天,每日记录小鼠体重及疾病活动指数,第9天处死小鼠,取结肠组织制作病理切片,取血清进行多因子检测。(3)CM-DiI对人胚胎来源间充质干细胞进行染色标记,将C57BL/6小鼠分为3组:空白对照组(不做干预),静脉注射组(注射1 × 106 CM-DiI标记细胞),腹腔注射组(注射1 106 CM-DiI标记细胞),处理后1天处死小鼠,取小肠、结肠、肝、肺组织制作冰冻切片,DAPI染色后荧光显微镜下观察。研究结果1.人胚胎来源间充质干细胞的诱导及鉴定(1)人胚胎干细胞在加入刺激剂(BMP-4、A83-01)后5天时间内经“滋养层样细胞”过渡阶段转化为间充质干细胞。(2)该细胞表达 CD73(91.2%)、CD90(90.6%)、CD105(99.4%)。2.胚胎来源间充质干细胞动物性抗原及免疫调节功能评估(1)用基质胶处理的MSC表达Neu5Gc(7.85%),用明胶、胶原处理MSC不表达 Neu5Gc(分别为 0.064%、0.85%)。(2)K562共培养组随着NK细胞增多,7-AAD 阳性率增加(2.35%上升至31%),MSC共培养组随着NK细胞增多,7-AAD 阳性率未增加(0%上升至0.13%)(3)随着MSC细胞的增多,CD4+T细胞及CD8+T细胞BruU阳性率下降,CD4+T细胞BruU 阳性率由59.3%降至12.1%,CD8+T细胞BruU阳性率由70.4%降至27%。3.人胚胎来源间充质干细胞对硫酸葡聚糖(DSS)结肠炎小鼠治疗模型建立及体内示踪研究(1)人胚胎来源MSC静脉注射对小鼠DSS结肠炎有治疗作用,治疗组体重下降减轻,炎症活动度(DAI)评分下降,组织学炎症减轻,血清中炎症因子含量减少。(2)人胚胎来源MSC静脉注射后大部分定植于肝肺组织,少部分定植于小肠下段。研究结论1.人胚胎干细胞可以被诱导为间充质干细胞,须经过“滋养层样细胞”的过渡阶段,诱导细胞表达MSC所必须的表面标记。2.人胚胎来源间充质干细胞能够逃避NK细胞的杀伤,也能够抑制T淋巴细胞的增殖。3.人胚胎来源间充质干细胞对小鼠DSS结肠炎有治疗作用,静脉注射后细胞定植于肝、肺及小肠上段。