miR-142-5p通过靶向调控SOCS1参与溃疡性结肠炎发生的机制研究

来源 :河北医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:wanshixian
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炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD),其发病机制仍未完全明确,遗传、环境、免疫因素及肠道感染等均可能参与IBD的发病。近年研究认为,肠道黏膜免疫系统功能紊乱、炎症因子分泌增多、肠道菌群紊乱、肠道黏膜屏障功能破坏亦参与UC的发生。核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路调节促炎因子表达,UC患者NF-κB相关因子表达升高,促进肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、IL-8等表达。越来越多研究证据表明UC患者发生肠上皮功能失调,然而具体分子机制有待深入研究。微小核糖核酸(Micro RNA,miRNA)是一类单链小分子非编码RNA,通过碱基互补配对的方式与靶基因m RNA 3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’UTR)结合,调控转录后基因表达而参与组织器官发育形成、炎症反应、免疫反应、肿瘤形成等过程。人miR-142最初在造血干细胞中被发现,miR-142前体可以生成miR-142-3p和miR-142-5p两种成熟miRNA。有研究发现miR-142-5p在UC患者肠黏膜组织及外周血中表达升高,并且与活动度、病变部位等因素相关,推测其可能参与UC发病,但具体作用机制尚未明确。细胞因子信号抑制因子1(Suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)是SOCS家族的重要成员,是通过反馈作用机制抑制细胞因子信号转导的负性调节因子。既往研究发现SOCS1在细胞分化、调控炎症、免疫反应和调节代谢等多种生理病理过程中发挥重要作用,其中,SOCS1可通过酪氨酸激酶(Janus kinase,JAK)/信号转导与转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)信号通路、NF-κB信号通路参与UC的发病。既往关于巨噬细胞、固有淋巴细胞分化及多发性硬化症发病的研究证实,SOCS1是miR-142-5p的靶基因,miR-142-5p通过靶向调控SOCS1参与上述细胞分化过程及疾病发病过程。那么,miR-142-5p是否可通过靶向调控SOCS1而参与溃疡性结肠炎的发生发展尚不得而知,本研究拟通过观察UC患者miR-142-5p、SOCS1的表达变化,分析两者的相关性,并构建UC体外细胞培养模型研究探讨miR-142-5p调控SOCS1作用对肠上皮细胞炎症反应的影响,阐明UC发病的分子调控机制,以期为UC治疗提供新的理论依据。具体实验分为以下三个部分:第一部分miR-142-5p和SOCS1在溃疡性结肠炎患者结肠黏膜中的表达变化目的:探讨miR-142-5p及SOCS1在溃疡性结肠炎患者结肠黏膜中的表达变化及两者的相关关系。方法:选取活动期UC患者25例(AUC组)、缓解期UC患者19例(PUC组)及正常对照个体21例(NC组),其中AUC组患者按照病变严重程度分为轻、中、重度3个亚组,病例数分别为10例、8例、7例,收集结肠黏膜组织。采用基因芯片技术分析3例AUC患者及3例正常对照者miR-142-5p表达差异;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCT)技术检测miR-142-5p m RNA在结肠黏膜组织中的表达,分析其与UC患者临床特征的关系。采用qRT-PCR技术和Western Blot技术检测SOCS1在各组结肠黏膜组织中的表达;分析miR-142-5p与SOCS1表达水平的相关性。结果:基因芯片检测显示,miR-142-5p在活动期UC组织中表达升高。qRT-PCT检测各组miR-142-5p在结肠组织中的表达,AUC组miR-142-5p m RNA相对表达量(2.45±0.09)明显高于PUC组(1.27±0.07)及NC组(1.01±0.07),P<0.05。miR-142-5p表达在不同疾病程度、不同患者来源、不同治疗方法间存在差异,P<0.05。Western Blot技术检测各组SOCS1蛋白表达,AUC组(0.49±0.20)SOCS1蛋白表达低于NC组(0.93±0.18)及PUC组(0.80±0.16),P<0.05。SOCS1表达水平与miR-142-5p表达水平呈负相关(Pearson correlation r=-0.655,P<0.01)。结论:miR-142-5p在活动期UC患者肠黏膜组织中表达水平升高,与疾病严重程度相关。SOCS1在UC患者表达降低,与miR-142-5p表达水平负相关。第二部分miR-142-5p的靶基因预测及鉴定目的:预测及鉴定miR-142-5p的靶基因,并探讨miR-142-5p对肠上皮细胞靶基因表达变化的影响。方法:利用miRTar Base、Target Scan及miRDB在线软件预测miR-142-5p靶基因,判断靶基因3’URT位点与miR-142-5p位点的重合情况。利用Targetscan和Pic Tar在线软件,构建靶基因3’UTR双荧光素酶报告基因野生型及其突变型载体,并与miR-142-5p mimic/inhibitor共转染HT-29细胞,并利用双荧光素酶检测系统检测其活性。使用miR-142-5p mimic/inhibitor转染TNF-α处理的HT-29细胞,采用Western Blot方法检测靶基因蛋白表达变化。结果:采用生物学信息分析方法预测SOCS1是miR-142-5p的靶基因,SOCS1的3’UTR含有miR-142-5p预测的结合位点和突变位点。双荧光素酶检测报告显示,与转染mimic NC相比,转染miR-142-5p mimic抑制SOCS13’UTR(野生型)荧光素酶活性(1.01±0.01 vs 0.49±0.12,P<0.05);与转染inhibitor相比,转染miR-142-5p inhibitor增强SOCS1 3’UTR(野生型)荧光素酶活性(1.02±0.01 vs 1.54±0.21,P<0.05);miR-142-5p mimic/inhibitor不影响SOCS1 3’UTR(突变型)荧光素酶活性(1.01±0.01 vs 0.95±0.17,P>0.05;1.01±0.01 vs 0.99±0.20,P>0.05)。蛋白定量方法检测结果显示,与转染mimic NC相比,转染miR-142-5p mimic可以抑制SOCS1蛋白表达(1.05±0.12 vs 0.39±0.13,P<0.05),与转染inhibitor NC相比,转染miR-142-5p inhibitor则增强SOCS1蛋白表达(0.99±0.09 vs 1.42±0.23,P<0.05)。结论:SOCS1为miR-142-5p的靶基因,miR-142-5p抑制SOCS1表达。第三部分miR-142-5p调控SOCS1在肠道炎症发生中的机制研究目的:观察肠上皮细胞株在炎性环境中miR-142-5p、SOCS1的表达水平,分析miR-142-5p对SOCS1的调控作用及其在肠道炎症中的作用机制。方法:将人肠上皮HT-29细胞应用1ng/m L和10ng/m L的TNF-α分别处理1h、24h,采用qRT-PCT方法检测HT-29细胞中miR-142-5p及SOCS1m RNA的表达情况,采用Western Blot方法测定SOCS1蛋白表达情况。使用miR-142-5p mimic/inhibitor转染TNF-α处理的HT-29细胞,采用qRT-PCR方法检测HT-29细胞中IL-6、IL-8 m RNA的表达水平,采用ELISA方法检测培养液中IL-6、IL-8浓度水平,观察转染后IL-6、IL-8的表达情况。将HT-29细胞利用4组SOCS1 si RNA转染48h后,采用qRT-PCR方法筛选出转染效率较高的si RNA。将HT-29细胞利用miR-142-5p inhibitor分别与SOCS1si RNA、对照si RNA共转染48h后,采用qRT-PCR方法检测HT-29细胞中IL-6、IL-8 m RNA水平,采用ELISA方法检测培养液中IL-6、IL-8浓度。采用Western Blot检测HT-29细胞转染miR-142-5p mimic/inhibitor后IκB-α、p IκB-α及p-p65变化。结果:qRT-PCT方法检测结果显示,与1ng/m L TNF-α(1.13±0.20)和对照组(0.97±0.13)相比,10ng/m L TNF-α刺激1h后,HT-29细胞miR-142-5p表达水平(2.19±0.28)明显升高,P<0.01;与1ng/m L TNF-α(1.34±0.26)和对照组(1.00±0.16)相比,10ng/m L TNF-α刺激24h后,HT-29细胞miR-142-5p表达水平(2.83±0.54)明显升高,P<0.01。qRT-PCT方法检测结果显示,与1ng/m L TNF-α(0.86±0.11)和对照组(1.08±0.13)相比,10ng/m L TNF-α刺激1h后,HT-29细胞SOCS1表达水平(0.52±0.10)明显降低,P<0.01;与1ng/m L TNF-α(0.83±0.10)和对照组(1.05±0.11)相比,10ng/m L TNF-α刺激24h后,HT-29细胞SOCS1表达水平(0.39±0.18)明显降低,P<0.01。采用蛋白定量检测,与对照组(1.06±0.17)相比,10ng/m L TNF-α刺激1h和24h后,HT-29细胞SOCS1表达水平(0.60±0.15;0.50±0.14)明显降低,P<0.05;Western Blot检测显示,与对照组相比,10ng/m L TNF-α刺激1h和24h后,HT-29细胞SOCS1表达水平明显降低。与转染NC相比,对TNF-α刺激的HT-29细胞转染miR-142-5p mimic后,细胞中IL-6(1.00±0.14 vs 1.62±0.22,P<0.05)、IL-8(1.00±0.20 vs 1.66±0.22,P<0.05)m RNA表达水平和细胞培养液中IL-6(187.39±48.76 vs 388.13±62.12,P<0.05)、IL-8(307.18±46.35 vs 530.14±50.95,P<0.05)升高;与转染NC相比,转染miR-142-5p inhibitor后,细胞中IL-6(1.04±0.13 vs 0.57±0.10,P<0.05)、IL-8(1.01±0.18 vs 0.54±0.13,P<0.05)m RNA表达水平和细胞培养液中IL-6(219.15±50.89 vs 148.78±26.38,P<0.05)、IL-8(330.68±48.05vs 199.22±20.70,P<0.05)降低。qRT-PCT方法检测结果显示,使用4组SOCS1 si RNA转染48h后,si SOCS1-1组(0.39±0.09)和si SOCS1-2组(0.35±0.06)较对照组(1.03±0.17)SOCS1表达明显降低,P<0.05;其余两组无明显变化,P>0.05。进一步使用蛋白定量检测显示,si SOCS1-1组(0.39±0.11)和si SOCS1-2组(0.36±0.11)较对照组(1.02±0.19)SOCS1表达明显降低,P<0.05;Western Blot方法检测提示si SOCS1-1组和si SOCS1-2组SOCS1蛋白表达降低。在TNF-α刺激后HT-29细胞中将miR-142-5p inhibitor与两组特定的SOCS1 si RNA共转染。分别使用qRT-PCR和ELISA检测结果提示,与对照组相比(0.96±0.15),si SOCS1-1和si SOCS1-2分别增加IL-6(1.47±0.20;1.63±0.24),P<0.05;与对照组相比(1.03±0.13),IL-8(1.69±0.23;1.63±0.24)表达水平增加,P<0.05;与对照组相比(211.01±37.75),细胞培养液中IL-6(335.24±46.96;356.17±52.23)浓度增高,P<0.05;与对照组相比(273.29±34.90),IL-8(439.59±49.24;413.97±48.14)浓度增高,P<0.05。Western Blot方法检测,转染miR-142-5p mimic可以抑制IκB-α蛋白表达水平,并增加p IκB-α和p-p65蛋白水平,而miR-142-5p inhibitor则抑制p IκB-α和p-p65蛋白表达水平,增加IκB-α蛋白表达水平。结论:炎症环境可以影响肠上皮细胞miR-142-5p和SOCS1的表达水平,过表达miR-142-5p诱导炎症因子产生及释放,miR-142-5p通过介导NF-κB信号通路抑制SOCS1表达进而调节肠道炎症反应。
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