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骨肿瘤占儿童肿瘤的3-5%，占成人肿瘤的不足1%。在原发性恶性骨肿瘤中发病率位于前三位的分别是骨肉瘤35.1%，软骨肉瘤25.8%，尤文氏肉瘤16.0%[1-4]。目前对于恶性骨肿瘤的病因及发病机制仍有待进一步研究。近年来虽然采用新化疗药物及联合化疗，但恶性骨肿瘤的生存率并无明显提高。因此，从事肿瘤治疗研究的学者们希望更为透彻的了解恶性骨肿瘤的发病机制，为肿瘤的治疗提供新的靶点。激活素A（ActivinA）属于转化生长因子β (TGF-β)超家族成员，是一种多功能生长和分化因子，在胚胎形成，细胞增殖和分化，细胞凋亡等多方面扮演着重要角色，参与细胞周期阻滞和诱导凋亡。激活素A具有多种生物学活性，其作用于不同靶细胞产生的效应不同，与多种肿瘤的发生、恶性程度的高低及转移有关。在卵巢癌中Activin A能明显增加Smad2的表达水平，进一步研究发现ActivinA通过自分泌作用促进人卵巢透明细胞腺癌的增殖。另有研究认为ActivinA通过激活Akt及抑制糖原合酶激酶(glycogensynthase kinase, GSK)促进细胞增殖，促进卵巢细胞癌变。在乳腺癌中最近研究发现Activin A通过下调端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, hTERT)的表达抑制端粒酶的活性从而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。在肝脏肿瘤中Activin A具有抑制肝癌细胞增殖诱导凋亡的作用。而激活素及其特异信号传导途径对于骨肿瘤的作用及具体机制，仍然缺乏相关报道。卵泡抑素（Follistatin, FS）又称激活素结合蛋白，是一种单链糖蛋白，是高亲和力的激活素A结合蛋白。ActivinA与FS通常共同表达，在细胞的增殖，分化，凋亡及肿瘤形成过程中发挥重要作用，这两种细胞因子中的任何一个表达降低或过度表达均会造成Activin–FS系统的失衡，从而导致疾病的发生。ActivinA表达失调在易发生骨转移的恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤中已经被证实。虽然仍缺乏ActivinA与骨原发性恶性肿瘤间关系的直接证据，目前大量的研究仍提示Activin A可能与骨原发性恶性肿瘤的增殖、转移及骨溶解有重要联系。阐明Activin A与骨原发性恶性肿瘤间的关系对于设计新的更有效的化疗药物及建立新的基因治疗靶点具有非常重要的意义。本实验的目的就是为了揭示ActivinA–FS系统表达失衡在骨原发性恶性肿瘤中的表达及作用，具体研究如下：1实验路线1.1Real time PCR检测不同组织来源的肿瘤细胞系Activin A、FS mRNA水平培养人前列腺癌细胞系Pc-3M、DU145，人卵巢癌细胞系Sk-ov-3，人骨肉瘤细胞系MG63，人肺癌细胞系NCI-H292、A549，人宫颈癌细胞系heLa，人膀胱癌细胞系5637，人乳腺癌细胞系MCF7，人肝癌细胞系Hep G2，人胰腺癌细胞系BaxPc-1等多种肿瘤细胞至对数生长期，收细胞，提取总RNA，通过Real time PCR检测各肿瘤细胞系Activin A、FS mRNA水平，筛选高表达Activin A、FSmRNA的肿瘤进行深入研究。1.2免疫组化验证高表达FS mRNA的骨肉瘤、肺癌、卵巢癌是否表达FS成熟蛋白采用石蜡组织切片，经常规脱腊、抗原修复行免疫组化染色，光学显微镜观察染色结果。验证高表达FS mRNA的肿瘤组织是否表达成熟的FS蛋白。1.3Real time PCR检测骨肉瘤、软骨肉瘤Activin A、FS mRNA表达为了分析骨肿瘤发生与ActivinA-FS表达失衡的关系，Real time PCR检测骨肉瘤与骨瘤、软骨肉瘤与软骨瘤Activin A、FS mRNA表达水平差异。所有肿瘤组织样本均取自术中切除的肿瘤组织。1.4免疫组化、Weastern blot检测骨肉瘤、软骨肉瘤组织Activin A、FS表达水平免疫组化、Weastern blot检测骨肉瘤与骨瘤、软骨肉瘤与软骨瘤组织ActivinA、FS表达差异及组织、细胞分布特点。1.5免疫组化、Weastern blot检测骨肉瘤、软骨肉瘤组织ActRⅡA表达水平Activin A通过与细胞膜上ActRⅡA结合进行信号传导从而发挥生物学作用。故实验检测骨肉瘤与骨瘤、软骨肉瘤与软骨瘤组织ActRⅡA表达差异，以进一步确定Activin A-FS系统失衡在骨肉瘤、软骨肉瘤发生中的意义。1.6血清Activin A、FS水平检测所有患者静脉血均采于入院后第二日早晨，-80℃储存。使用R&D公司提供的ELISA试剂盒检测血清Activin A、FS水平。2结果2.1Real time PCR结果显示：骨肉瘤细胞MG63、卵巢癌细胞SKOV3、肺癌细胞A549均高表达FS、Activin A mRNA。2.2对骨肉瘤组织、卵巢癌组织、肺癌组织进行抗FS免疫组化染色结果显示：骨组织、卵巢癌组织、肺癌组织可见FS阳性染色。2.3Real-Time PCR结果显示，骨肉瘤、软骨肉瘤组织中FS、Activin A-mRNA含量显著高于骨瘤、软骨瘤组织，其中Activin A-mRNA升高程度显著高于FS-mRNA。2.4进一步比较成骨细胞来源地良性骨病及骨肉瘤的组织FS、Activin A染色情况，结果显示，骨肉瘤细胞Activin A、ActRⅡA表达显著高于骨瘤细胞，基质亦呈明显的棕黄色阳性染色；而FS染色与良性骨病组织中成骨细胞无明显差异。2.5同时比较软骨细胞来源的良性软骨疾病软骨瘤及恶性软骨疾病软骨肉瘤的组织FS、Activin A染色情况，结果显示，软骨肉瘤细胞细胞浆中Activin A、ActRⅡA较软骨瘤表达水平显著增高，FS表达水平无显著差异。2.6Weastern blot结果显示，骨肉瘤组织中Activin A含量显著高于骨瘤组织，而FS表达水平无显著差异；软骨肉瘤组织中Activin A含量显著高于软骨瘤组织，而FS表达水平无显著差异。2.7留取健康人、骨肉瘤患者外周血，检测血清中Activin A、FS含量，结果显示Activin A在骨肉瘤患者外周血中含量明显高于健康对照组， FS含量与健康对照组相比无明显差异。3结论3.1Activin A及FS mRNA在骨肿瘤、泌尿、生殖系统肿瘤、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤细胞广泛存在，在骨肉瘤细胞、卵巢癌、肺癌中表达水平较高。3.2本研究结果揭示Activin A–FS系统失衡可能与恶性成骨性肿瘤、恶性成软骨性肿瘤的发生有关，ActivinA是该病的重要致病因素，可能是恶性成骨性肿瘤、恶性成软骨性肿瘤的新的基因治疗靶点。3.3血清Activin A检测可能对骨肉瘤的早期诊断有一定的意义。