目的:通过基因工程重组技术,利用已合成的抗乳腺癌单链抗体基因ScFv,及自绿脓杆菌基因组扩增的其外毒素基因PE40,采用重叠延伸基因拼接法(gene splicing by overlap extension)使二者连接.并利用扩增时导入的两端酶切位点,采取酶切使之克隆入表达载体pET21a(+).构建好的免疫毒素表达载体为以后的高效表达、纯化及细胞毒实验打下了基础.可望为乳腺癌及其他肿瘤的临床治疗提供一种新的选择.方法:1、PCR扩增:设计引物扩增ScFv时在其5端加入EcoRI酶切位点,扩增PE40时在其3端也加入EcoRI位点,在自绿脓杆菌基因组DNA中扩增PE40时采用了改良套式PCR法;2、基因片段的连接:扩增ScFv的3引物与扩增PE40的5引物二者有一段序列完全相同,因此使用重叠延伸基因拼接法使二者连接;3、融合基因导入载体:融合基因与载体pET21a(+)均以EcoRI酶切,形成粘性末端,因而可以顺利导入;4、重组体的筛选及序列分析:碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定,以确定载体中有无插入序列及插入的方向.5、序列分析:正在进行中.结论:1、构建抗人乳腺癌免疫毒素表达系统获得成功;2、在PCR扩增原核基因PE40时,由于引物与模板G、C含量较高,加入变性剂DMSO使PCR成功的可能性大大增加,我们在实验中使用改良套式PCR亦获得成功;3、采用重叠延伸基因拼接法连接两段基因序列,是进行基因拼接表达的理想方法,在两段基因接头处无需加入任何与模板不相关的碱基现时使两段任意来源的基因片段直接相连,也不需要加入任何酶切位点.进行扩增的时候,计算好退火温度,使用高保真的Taq酶往往能达到满意的扩增效果.