柑橘是我国乃至世界重要的果树类经济作物,而病毒病害是柑橘产业发展的重要限制因素。已知感染柑橘的病毒超过20种,但柑橘上病毒的种类可能远不止于此。病毒的鉴定是防控其发生流行的重要基础,故有必要加大力度调查柑橘上病毒的多样性,从而进一步完善防控体系,促进柑橘产业的可持续发展。高通量测序技术已应用于柑橘病毒的鉴定,但存在一定局限性:一方面,针对大批量样品中的宏病毒组,柑橘上尚缺乏一套可供参考的标准分析方法;另一方面,常规的病毒注释方法（BLASTX）对部分多组分病毒并不适用。针对以上问题,本研究系统地构建了适用于单组分和多组分病毒的柑橘宏病毒组分析平台。应用此平台分析了单株柑橘样品B2-R20中植物病毒组情况,鉴定到了1个多组分新病毒——柑橘Jivivirus相关病毒1（Citrus jivi-related virus 1,CJVV1）,并分析了其分子特征和进化地位。进一步应用此平台分析了1个柑橘混样CV1（50株）中植物病毒的物种多样性,从中鉴定到了1个单组分新病毒——柑橘伴随弹状病毒（Citrus-associated rhabdovirus,CiaRV）。在此基础上,深入研究了CiaRV与三种植物共进化的分子和生物学特征。研究的具体结果如下:1.柑橘宏病毒组分析平台的构建该平台基于去除核糖体RNA的双端RNA测序（Paired-end RNA sequencing,PE RNA-seq）技术,对病毒contigs的注释采用BLASTX和基于保守非编码区的迭代BLASTN（Untranslated region-based iterative BLASTN,UTR-i BLASTN）,分别针对单和多组分病毒的挖掘。RNA-seq和小RNA测序（Small RNA sequencing,sRNA-seq）是柑橘上应用较广泛的病毒分析策略,以柑橘样品UN8为例,通过PE RNA-seq能获得UN8中已知病毒的近全长contigs,而sRNAseq则不能;通过BLASTX和UTR-i BLASTN能够分别注释UN8中的单组分和多组分病毒;统计分析显示UTR-i BLASTN对多组分病毒的适用范围广,涵盖了至少17个病毒科,其寄主涉及无脊椎动物、植物、真菌、细菌、原生生物。以上结果表明构建的柑橘宏病毒组分析平台具有较强的实用性和较高的应用价值。2.柑橘多组分新病毒CJVV1的分子鉴定应用柑橘宏病毒组分析平台从1个柑橘田间样品中鉴定到了1个六组分新病毒,进而从3个NCBI数据库中鉴定到了7种同源新病毒,最后从序列和进化上对CJVV1和相关病毒的进行了系统地分析。对CJVV1的序列分析显示:1)RNA1-3为单顺反子,其中RNA1编码的假定蛋白的大小约为147.4 k Da,其上具有甲基转移酶（Methyltransferase）和解旋酶（Helicase,Hel）的保守结构域;2)RNA2假定蛋白的分子质量约为115.9 k Da,具有Rd RP（RNA-dependent RNA polymerase）的结构域特征;3)RNA3的73.9-k Da假定蛋白表现出另一类Hel（DEADlike＿helicase＿N Superfamily）的结构域特征;4)CJVV1的RNA4-5（a、b）为双顺反子,其编码的假定蛋白的功能未知,其中RNA5a的2个假定蛋白为P18a（18.2 k Da）和P46（46.8 k Da）,RNA5b的假定蛋白为P18b（18.98 k Da）和P50（50.8 k Da）,P46和P50可能同源（BLASTP＿evalue=6.96E-10）,但仅P46具有2个锌指蛋白结构域（Zn F＿U1;zf-3Cxx C）,且其可能与真菌蛋白同源（PSI-BLASTP＿e-value=E-10）。进一步对CJVV1和相关病毒的序列进行比对和进化分析,得到结果如下:1)病毒基因组组份的5′-UTRs具有相似的保守序列;2)病毒基因组组份在氨基酸序列上同源,BLASTP＿e-values＜6.16E-6;3)RNA1s（或RNA2s）和RNA3s编码的假定蛋白分别与黄病毒门（Kitrinoviricota）下披膜病毒科（Togaviridae）和超群病毒门（Pisuviricota）下马铃薯Y病毒科（Potyviridae）的亲缘关系最近,这表明CJVV1和相关病毒可能是这两类病毒重组的产物,其代表了马泰利病毒目（Martellivirales）下一个新的分类单元。上述结果进一步说明了柑橘宏病毒组分析平台的实用性。3.柑橘单组分新病毒CiaRV与三种植物共进化研究应用柑橘宏病毒组分析平台首次开展了柑橘宏病毒组分析研究,从田间柑橘混样中鉴定到了4种已知病毒和2种新病毒,而后对单组分新病毒CiaRV与三种植物共进化的分子和生物学特征进行了系统性地研究。主要从以下三个方面展开:1)基于CiaRV的7个准种和测序片段定位（Reads mapping）,利用箱形图、热图、皮尔逊相关性分析对G基因的变异水平进行评价;2)使用RT-PCR调查CiaRV在不同植物和粉虱群体上的分布情况;3)利用运动蛋白互补和嫁接实验分别探究柑橘分离物C1细胞间和植株间的运动能力。研究的结果和结论如下:1)G基因在7个准种内的变异水平较高,在该种群内的变异水平也较高,且不同基因在准种内和种群内的变异水平呈正相关,相关性显著（P-value＜0.05）且强（|r|＞0.8）,这表明G基因为基因组上一个进化热点区域;2)同一地域中CiaRV在百香果（75%）和结香（63%）上的检出率远高于柑橘（1.5%）,同时带毒百香果和结香上的烟粉虱中能检测出CiaRV,而带毒柑橘上的柑橘粉虱中未能检测出CiaRV,因而推测CiaRV的介体为烟粉虱,而G缺陷使CiaRV丧失了被烟粉虱传播的能力;3)CiaRV-C1的P3能够恢复两种运动缺陷型植物病毒的胞间运动能力,从嫁接的两种柑橘砧木的系统叶上都检测到了CiaRV-C1,结果表明CiaRV-C1具有在柑橘植株内和植株间移动的能力。最后,依据CiaRV的分子和生物学特性提出了CiaRV–三种植物共进化假说,推测较高的变异水平、缺少介体的选择压力、在柑橘上传播方式的改变是G基因发生缺陷的关键条件;该假说为解释柑橘病毒的起源、发生和流行提供了一个重要实践参考。