糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy,DR）是糖尿病的重要并发症之一,患者视网膜由于内环境的改变而发生病变,依次发生微动脉瘤、视网膜内出血、静脉串珠样病变,以及新生血管生成等四项重要病理进程。在病情发展过程中,患者极其痛苦,并且发展过程难以逆转。转甲状腺素蛋白（Transthyretin,TTR）是一种四聚体载体蛋白,具有转运甲状腺素的生理作用,许多研究表明TTR可以抑制新生血管生成,从而干预DR的进程,然而其机制尚未被完全阐释。因此,本研究综合运用生物工程以及分子生物学的方法,对TTR进行改造以探寻其干预DR中新生血管生成的作用机制。本实验主要分为三个部分。首先,前期实验证明,TTR可以进入细胞核,说明TTR可以与细胞核中的蛋白质发生共同作用。将视网膜内皮细胞裂解,取全细胞蛋白,开展基于TTR的免疫沉淀实验,以质谱检测所有与TTR结合的蛋白质,发现核内不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hn RNP）A2B1具有显著的丰度,说明TTR可能与hn RNPA2B1间存在相互作用。而Discovery软件的Z-DOCK分子对接模拟显示,TTR与hn RNPA2B1间的空间结合较好,存在三处主要的空间结合区域:34-39:-RKAADD-,61-68:-EEEFVEGI-,以及95-102:-TANDSGP-,即两者的相互作用存在理论基础。针对这三处空间结合区域,采用氨基酸定点突变的方法对TTR进行了结构改造,设计了六种TTR突变体,在经过了表达条件优化后,其中的五种能够以大肠杆菌（Escherichia coli）作为宿主成功表达。其次,在分子生物学与细胞生物学实验部分,进行hn RNPA2B1与原始TTR以及TTR突变体间的免疫共沉淀以验证其结合能力,开展细胞功能实验考察原始TTR以及TTR突变体在高糖环境下对于视网膜内皮细胞功能的影响,并通过免疫印迹与定量PCR检测相关蛋白与基因的表达水平。免疫共沉淀实验显示,TTR与hn RNPA2B1可以相互捕捉,即两者间确存在直接相互作用。与原始TTR相比,被TTR突变体拉下的hn RNPA2B1含量显著降低,然而被hn RNPA2B1拉下的原始TTR与TTR突变体却无显著差异,这说明TTR与hn RNPA2B1并非传统的上下游调控关系。在视网膜内皮细胞的培养基中加入相同浓度的原始TTR和TTR突变体,观察其对细胞增殖、迁移以及血管形成的影响,原始TTR能够较好的抑制高糖环境下的细胞增殖、迁移及血管形成至接近正常环境下的水平,而TTR突变体的抑制效果则大大减弱。检测加入原始TTR和TTR突变体后细胞内相关基因及蛋白的表达变化,发现hn RNPA2B1的表达不受影响,而STAT4、FBXW7、mi R-223-3p、Notch1以及p-Akt的表达均显著变化,说明TTR在不影响hn RNPA2B1表达水平的前提下干预了下游通路的表达,两者间可能是通过形成复合体的方式来共同发挥调控作用。最后,在动物实验部分,为了直观的观察原始TTR和TTR突变体对DR新生血管生成的影响,采用玻璃体腔注射的方法,以腺病毒为载体在糖尿病大鼠眼内表达原始TTR和TTR突变体。埃文斯蓝染色显示,原始TTR可以有效减少糖尿病鼠视网膜渗漏出血区域,TTR突变体的干预效果则大大降低。PAS染色表明原始TTR可以显著抑制新生血管生成,而突变体则几乎没有抑制效果。整合三部分的实验结果说明,TTR与hn RNPA2B1形成复合体,又通过STAT4/mi R-223-3p/FBXW7通路发挥新生血管生成拮抗作用的,而TTR与hn RNPA2B1的三处空间结合区域都在拮抗机制中起到了重要作用。本研究确认了TTR对DR新生血管生成的抑制作用,初步建立了TTR的分子作用通路,为阐明DR的发病机理以及未来对DR的治疗提供了理论基础。