沙门菌是常见的人畜共患病原菌,给人和动物的健康带来严重威胁。随着近几十年来抗菌药物的广泛使用,沙门菌对常用抗菌药物的耐药性日益增长,其多重耐药问题已成威胁公共卫生、食品安全、畜禽养殖的突出问题。TCS是细菌中普遍存在的一种信号传递系统,与细菌的抗酸性、趋化性、耐饥饿、耐药性、致病性等多种性状密切相关,是极具吸引力的抗菌作用新靶点。本实验选取革兰氏阴性菌中普遍存在的TCS之一cpxAR系统作为研究对象,以鸡源鼠伤寒沙门菌标准菌株CVCC541基因组DNA为模板,PCR扩增cpxR的完整ORF。回收纯化后的PCR产物与pBAD/HisA质粒载体同时用XholⅠ和HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后用T4 DNA ligase连接,连接产物用化学转化法转入感受态细胞DH5a。提取蓝白斑筛选的阳性克隆质粒,将经测序鉴定构建成功的pBAD/HisA-cpxR过表达质粒电击转化入感受态细胞JS_标、JS_标△cpxR、JS_标△acrB、JS_标△cpxR△acrB中,成功构建出以上各菌的cpxR过表达菌株。采用微量肉汤稀释法测定了12种不同抗菌药物对JS_标及以JS_标为母本构建的其它工程菌的MIC。结果显示:cpxR的缺失可使JS_标对硫酸庆大霉素、阿米卡星、头孢噻呋钠的敏感性提高4倍,而该基因缺失后的cpxR过表达菌株对硫酸庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、头孢曲松钠、头孢噻呋钠的敏感性分别降低为原来的1/16、1/8、1/4、1/16、1/8。acrB基因缺失后菌体对多西环素、硫酸庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、粘菌素、头孢噻呋钠敏感性升高4~12倍。cpxR的过表达使acrB缺失菌对多西环素和粘菌素的敏感性降低为原来的1/4,使多西环素、阿米卡星、喹乙醇、环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻呋钠对该菌的MIC降低为JS_标的1/8、1/4、1/8、1/8、1/4、1/16。以上数据说明:cpxAR可使沙门菌对四环素类、氨基糖苷类、头孢菌素类、氯霉素类抗生素敏感性下降,且acrB缺失时,cpxAR对多重耐药的调控更为显著。用荧光定量RT-PCR方法测定了JS_标、JS_标△cpxR、JS_标△acrB、JS_标△cpxR△acrB及其cpxR过表达菌株外排泵基因acrB、acrD、acrF、Tol C、mdtA及调控基因marA、soxS的mRNA表达水平,研究各基因表达与cpxAR的关系。结果发现:cpxR过表达时soxS、TolC的表达量都不同程度的降低;cpxR在JS_标和JS_标△cpxR中过表达时,主动外排基因acrB表达量分别下降为原来的2.22%、19%;在acrB基因敲除之前,acrD基因在菌株JS_标、JS_标cpxR、JS_标△cpxR及JS_标△cpxR-/HisA-cpxR中的表达量随着cpxR基因的过表达略有升高,在acrB基因敲除之后,acrD基因的表达量随着cpxR的过表达而显著升高。以上结果表明:cpxAR可下调soxS、TolC、acrB基因的表达,且对acrD基因有上调作用,但该上调作用与acrB基因有重要联系。