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细菌是生物地球化学循环的重要参与者,在海洋高分子量有机质的降解中起重要作用,但是目前对于海洋细菌降解高分子量有机质的能力和机制仍然不完全清楚。假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)是属于γ-变形菌纲的一类海洋特有细菌,在全球海洋广泛分布。该属的多样性很高,目前该属已有41个种。目前,已从该属菌株中发现了多种不同类型的胞外酶,说明该属细菌很可能在海洋高分子量有机质的降解中起重要作用。但是,目前对于该属对高分子量有机质的降解能力尚缺乏系统认识。海藻酸是褐藻细胞壁的主要成分,几丁质则是甲壳类动物外骨骼的典型成分,这两类多糖在海洋中储量巨大。已有研究从假交替单胞菌中分别发现了海藻酸裂解酶和几丁质酶,说明相应菌株分别具有降解海藻酸和几丁质的能力。本实验室前期已对假交替单胞菌属多个种进行了全基因组测序,本论文拟在此基础上,结合基因组比较分析和实验分析,系统研究该属对海藻酸和几丁质两类多糖的利用能力,揭示其降解和代谢途径,为阐明海洋细菌对高分子量有机质的降解机制奠定基础。1.假交替单胞菌属降解和代谢几丁质和海藻酸的途径通过基因组分析,从Pseudoalteromonas(P.rubra)、Pseudoalteromonas flavipulchra CP.flavipulchra)和 Pseudoalteromonas tetraodonis(P.tetraodonis)中,发现了几丁质的代谢途径,相关基因多数在染色体上聚集成簇。对P.rubra来说,在大小两条染色体上均有分布有4个基因簇。小染色体上的基因簇主要包含3个几丁质酶基因(PRUBb1435、PRUBb1437和PRUBb1438);而大染色上分布有3个基因簇,其中2个基因簇分别包含3个几丁质酶基因(PRUBa0113、PRUBa0115 和 PRUBa0117)和 2 个几丁质酶基因(PRUBa1269 和 PRUBa1270),这些几丁质酶主要参与几丁质降解为寡糖和单糖的过程。大染色体上还包含一个由 4 个基因(PRUBa4419、PRUBa4420、PRUBa4421 和 PRUBa4423)组成的保守基因簇,参与几丁质降解产物N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的转化,其中PRUBa4423(Kinase)、PRUBa4421(nagA)、PRUBa4419 分别负责 NAG 利用过程中的磷酸化、脱乙酰化和脱氨,之后,NAG转变为果糖-6-磷酸,进入到糖酵解途径中。与P.rubra类似,P.flavipulchra大小两条染色体上分布有4个几丁质酶基因簇。小染色体上的3个几丁质酶基因(PFLAb0431、PFLAb0432和PFLAb0434)构成一个基因簇,而氨基己糖苷酶基因(PFLAb0710和PFLAb0719)、信号蛋白基因(PFLAb0713)和转录调控基因(PFLAb0716)构成另外一个基因簇,小染色体上的这些基因参与几丁质降解为NAG的过程。大染色体上也有两个基因簇,PFLAa0063(GspK)、PFLAa0064(nagA)、PFLAa0066 和 PFLAa0067(nagB)构成一个基因簇,PFLAa3543(agaA)、PFLAa3544(nagK)和 PFLAa3548(agaR)构成另外一个基因簇,主要负责NAG的进一步利用。与P.rubra和flavipulchra不同,P.tetraodonis的基因簇主要在小染色体上,除两个几丁质酶基因(PTETb0328和PTETb0329)构成的基因簇外,还有一个由6个基因构成的基因簇,其中一个基因(PTETb0171,nagZ)编码的氨基己糖苷酶负责几丁寡糖的分解;ATP酶和脱乙酰化酶(PTETb0172和PTETb0174)则分别负责NAG的磷酸化及脱乙酰化,使其转变为葡萄糖胺-6-磷酸;转氨酶(PTETb0173)负责将果糖-6-磷酸转变为葡萄糖胺-6-磷酸;MFS transporter(PTETb0175)负责几丁质降解产物的转运;lacI家族转录调控因子(PTETb0169)则可能调控这个基因簇的转录。在Pseudoalteromonas agarivorans(P.agarivorans)中发现了海藻酸降解和代谢途径,发现多数基因存在于单个基因簇中。海藻酸裂解酶(PAGAa1382、PAGAa1383、PAGAa1393)负责将高分子量的海藻酸转变为不饱和的单糖醛酸;KdgF(PAGAa1384)和脱氢酶(PAGAa1381)负责将不饱和的单糖醛酸转变为2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸(KDG);2-脱氢-3-脱氧葡糖酸激酶(PAGAa1386)主要负责将KDG转变为2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(KDPG),KDPG进入Entner-Doudoroff(ED)途径。此外,ED途径的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶基因(PAGAa1388,eda)、糖酵解和糖异生途径的果糖二磷酸醛缩酶基因(PAGAa1390,fbaA)和果糖1,6-二磷酸酶基因(PAGAa1391,fbp)也位于该基因簇中。2.假交替单胞菌属不同种对几丁质和海藻酸降解和代谢能力的比较研究为了进一步在全属水平上了解本属对几丁质和海藻酸的利用,我们对不同分支的18个种的模式菌株的两类基因簇分布进行了全面分析。发现这两类多糖的降解和代谢途径在全属中的分布截然不同:分支L-Ⅰ、L-Ⅱ、L-Ⅲ、L-Ⅳ.1、L-Ⅳ.2和L-Ⅳ.3中几乎所有的种都含有几丁质降解和代谢途径,不含有海藻酸降解和代谢途径;与之相反,分支L-Ⅳ.4中几乎所有的种都含有海藻酸降解和代谢途径,而不含有几丁质降解代谢途径。据此,推测分支L-Ⅰ、L-Ⅱ、L-Ⅲ、L-Ⅳ.1、L-Ⅳ.2和L-Ⅳ.3具有几丁质利用能力,而家系L-Ⅳ.4则具有海藻酸利用能力。为了验证上述推测,本论文测试了上述18个种分别利用几丁质和海藻酸作为唯一碳源生长的能力。实验结果表明,含有几丁质利用基因簇的菌株部分能以几丁质为唯一碳源生长,多数能以NAG为唯一碳源生长,含有海藻酸利用基因簇的菌株多数能以海藻酸为唯一碳源生长,该结果证实了前面基因组注释和预测结果,揭示了假交替单胞菌不同种及不同分支在两类多糖降解和代谢能力上的差异。3.几丁质和海藻酸降解和代谢相关基因的转录情况本实验室的前期研究显示,P.tetraodonis(分支L-Ⅳ.3)和P.agarivorans(分支L-Ⅳ.4)在海洋环境中分布广泛、丰度很高。另外,实验分析表明,P.flavipulchra(分支L-Ⅲ)降解几丁质的能力较强。本论文以这三个种的模式菌株作为代表,研究了几丁质和海藻酸降解和代谢相关基因的转录情况。对P.tetraodonis的转录结果分析表明,与以海水2216培养及以葡萄糖为唯一碳源培养相比,以NAG为唯一碳源的条件下,NAG利用相关基因的转录均上调,说明NAG可能对这些基因的转录起了诱导作用。另一方面,比较P.teraodonis分别以NAG和葡萄糖为唯一碳源培养的转录组发现,NAG条件下,糖酵解、糖异生途径相关基因转录均上调,而ED途径中的基因转录则有不同程度下调,说明糖酵解途径在P.对NAG利用过程中发挥重要作用。对P.flavipulchra的转录结果分析表明,与以海水2216培养及以葡萄糖为唯一碳源培养相比,以NAG和几丁质分别为唯一碳源的条件下,几丁质利用基因簇中的几丁质酶基因、脱乙酰化酶基因和脱氨酶基因转录均上调,说明NAG和几丁质可能对这些基因的转录起了诱导作用。对P.agarivorans转录结果表明,与以海水2216培养及以葡萄糖为唯一碳源培养相比,在海藻酸为唯一碳源条件下,海藻酸利用基因簇中各基因转录上调,说明海藻酸可能对这些基因的转录起到了诱导作用;糖酵解和糖异生途径中的大部分基因转录下调,而ED途径中大多数基因转录上调,说明ED途径在P agarivorans的海藻酸利用过程中发挥重要作用。4.磷酸果糖激酶基因的敲除及其功能的初步分析比较基因组分析显示,含有几丁质降解代谢途径的菌株多数含有磷酸果糖激酶基因(pfkA),而含有海藻酸降解代谢利用途径的菌株则不含有该基因。果糖-6-磷酸是几丁质降解代谢的产物,磷酸果糖激酶是糖酵解途径的关键酶,负责将果糖-6-磷酸转化为1,6-二磷酸果糖。因此,该酶应该在几丁质的降解代谢中起重要作用。为进一步研究磷酸果糖激酶在几丁质降解代谢中的作用,本论文敲除了P.tetraodonis的pfkA基因,构建了敲除株△pfkA。分别以葡萄糖和NAG为唯一碳源培养,敲除株和野生株的生长曲线差异很小。这个结果暗示了 ED途径可能对糖酵解途径起到了补偿作用,但其机制有待进一步研究。综上所述,本论文综合比较基因组学、转录组学分析和实验分析,在全属水平上揭示了海洋特有细菌假交替单胞菌对几丁质和海藻酸两类海洋重要多糖的利用能力的差异及其基因组基础,为阐明海洋微生物的生态分化及其在海洋有机质地球化学循环中的作用奠定了基础。