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普鲁兰(Pullulan),又称为短梗霉多糖,是真菌茁芽短梗霉(Aureobasidium Pullulans)在菌体生长过程中产生的一种胞外多糖。它是由α-1,6葡萄糖苷键连接麦芽三糖构成的线性分子,此多糖在环境污染治理等领域具有广泛的应用前景。
因其产糖量低黑色素分泌多等因素,茁芽短梗霉N3.837尚不符合工业化发酵生产的要求,因此,本研究主要通过对出发菌株茁芽短梗霉N3.837原生质体制备方法进行优化,并对所获原生质体进行紫外诱变,最终筛选出2株产糖量高、黑色素产量低的优良突变株。此外,还对筛选得到的突变株的生长曲线以及细胞形态、多糖产量及pH值之间的相互关系进行了研究。具体工作如下:
(1)茁芽短梗霉N3.837原生质体的制备和再生条件研究。以茁芽短梗霉N3.837为研究对象,通过酶解法进行原生质体的制备,并对原生质体制备和再生的条件进行了探索,确定了最佳条件为:取菌龄为20小时的菌体,以1%的甘氨酸进行预处理30min,以25mmol /L Tris-HCl,pH 6.0,含0.5 mol /L KCl为高渗稳定液,用0.2%蜗牛酶+0.2%纤维素酶+0.2%溶菌酶的混合酶液(用0.1 mol /L Na2SO4,0.8 mol /L KCl,25mmol /L Tris-HCl,pH 6.0的缓冲液溶解),在酶解温度28℃、酶解pH 6.0的条件下处理1小时,原生质体形成率可达到97.14%,再生率为11.1%。
(2)原生质体紫外诱变和菌株的筛选。采用最优条件制备茁芽短梗霉原生质体,用15W紫外灯距离30㎝处进行不同时间的照射处理,初筛得到28株诱变菌株,对28株菌进行发酵,通过测定发酵液的总糖量、多糖量以及多糖转化率等,最终筛选出两株产糖量高、性状优良的突变株KR13和KR28,其多糖转化率分别为29.28%和26.92%,是出发菌株的3倍多。
(3)突变株的细胞形态、多糖产量及pH值的变化以及三者之间的相互关系研究。对突变株的发酵过程进行了进一步的研究得出,突变菌株的发酵周期由原来的72h缩短为65h,同时证明了酵母态细胞是合成普鲁兰的主要形态,普鲁兰的合成时间主要在稳定期的中后期,也就是40—70h之间,这为以后的普鲁兰发酵生产提供了实验依据。