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中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的水产养殖物种之一,具有重要的经济价值和科研价值。然而,细菌性疾病的频发为中华绒螯蟹养殖产业带来了严重的经济损失。本研究以中华绒螯蟹为研究对象,利用免疫荧光、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、免疫印迹实验(Western blot)和双链RNA干扰(Double strands RNA interference,dsRNAi)等生物学技术分析了Beclin(命名为EsBeclin-1)、腺苷酸激活蛋白激酶β亚基(AMP-activated protein kinaseβsubunit,AMPKβ,命名为Es AMPKβ)和Akirin(命名为EsAkirin)的分子特征及其参与调控抗菌肽表达的功能。EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的开放阅读框分别为1 275 bp、888 bp和615 bp,各编码424、295和204个氨基酸。EsBeclin-1具有典型的APG6结构域及CCD和ECD结构域;EsAMPKβ具有典型的AMPKβ和CBM结构域;EsAkirin没有明确的结构域,但具有较保守的氨基端和羧基端结构及两个保守的核定位序列。EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin均呈组成型表达。免疫荧光分析结果表明,EsBeclin-1和EsAMPKβ蛋白主要分布在血淋巴细胞细胞质中,EsAkirin主要分布在细胞核中。利用qRT-PCR检测了脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激后中华绒螯蟹血淋巴细胞中EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的表达变化情况。结果表明LPS和A.hydrophila刺激后,EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的mRNA表达水平显著升高,分别在刺激后6 h(为对照组的4.70±0.70倍和2.91±0.46倍,p<0.01)、12 h(为对照组的3.19±0.58倍和2.69±0.30倍,p<0.01)和24 h(为对照组的5.04±1.01倍和3.10±0.84倍,p<0.01)达到最高表达水平。此外,LPS刺激2 h后,血淋巴细胞中的EsBeclin-1蛋白出现聚集,呈斑点状分布。为研究EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin对抗菌肽表达的调节作用,本研究利用dsRNA抑制EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的表达(dsRNA注射24 h后干扰效率均达60%以上),并在此基础上对血淋巴细胞中抗菌肽的表达水平进行检测。结果表明,LPS刺激EsBeclin-1干扰的中华绒螯蟹6 h后,EsALF2(0.55±0.08倍,p<0.05)、EsLYZ(0.21±0.04倍,p<0.01)、EsCrus(0.49±0.08倍,p<0.01)和EsCrus2(0.46±0.11倍,p<0.01)的表达水平显著低于对照组;EsAMPKβ干扰后,EsALF2(0.44±0.10倍,p<0.01)和EsLYZ(0.69±0.20倍,p<0.05)的表达水平受到抑制;LPS刺激EsAkirin干扰的中华绒螯蟹12 h后,EsALF2(0.26±0.07倍,p<0.01)、EsLYZ(0.54±0.10倍,p<0.01)、EsCrus2(0.54±0.17倍,p<0.01)和EsDWD1(0.56±0.1倍,p<0.05)的表达量显著降低。利用双荧光素酶报告系统检测发现,EsAkirin能显著增强NF-κB启动子表达质粒的荧光素酶活性(2.72±0.40倍,p<0.01)。综上所述,EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的分子结构均较为保守,具有典型的结构特征;EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin都参与LPS和A.hydrophila刺激引起的免疫应答;EsBeclin-1和EsAMPKβ分布在中华绒螯蟹血淋巴细胞细胞质中,EsAkirin分布在细胞核中;EsBeclin-1能影响EsALF2、EsLYZ、EsCrus和EsCrus2的转录,EsAMPKβ参与EsALF2和EsLYZ的调节,EsAkirin在EsALF2、EsLYZ、EsCrus2和EsDWD1的调节过程中具有重要作用;EsAkirin能通过增强NF-κB的活性。以上结果表明EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin之间可能通过同一途径共同调节EsALF2和EsLYZ的转录,参与中华绒螯蟹抗细菌免疫。本研究不仅为进一步探索甲壳动物抗细菌免疫防御机制提供了理论依据,而且为无脊椎动物免疫调节机制的研究提供了参考。