在胚胎生长发育的整个过程中心脏是最早开始形成的内脏器官,也是维持个体生长发育的重要器官。已知心脏的发育受多条基因信号网络协同作用,其中任何因子发生突变或表达异常都将可能导致心脏发育缺陷。人类心脏发育异常是造成先天性心脏病发生的重要原因,且先天性心脏病在胎儿中的致死率最高,因此研究心脏发育基因的功能及其调控机制将为发展有效的治疗先天性心脏病的手段奠定理论基础。本课题主要探讨实验室前期筛选的心脏发育候选基因Mpr5与Tcap在斑马鱼心脏发育中的作用。本文首先利用原位杂交技术研究Mpr5和Tcap基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达,结果显示两者均在心脏位置高表达,该结果提示Mpr5和Tcap基因调控斑马鱼心脏发育。实验室前期研究表明Mpr5是母源基因,其未受修饰的母源蛋白在Mpr5敲除纯合子胚胎中对Mpr5敲除合子基因导致的早期胚胎心脏发育畸形表型具有明显的代偿作用。因此,本文利用一种新型降解目标蛋白的技术—Trim-Away技术在斑马鱼胚胎中降解Mpr5蛋白,研究其对早期胚胎心脏发育的影响。首先探究此技术最适的注射浓度为每颗胚胎1.5 ng。并且发现Trim-Away技术在可操作性上表现出明显的优势。随后对比Trim-Away技术、Morpholino敲减和CRISPR/Cas9三种方案,发现Trim-Away技术对于研究早期胚胎发育的母源调控因子的功能,均比Morpholino敲减和CRISPR/Cas9技术有着明显的优势。接着,本文运用Trim-Away技术研究斑马鱼Mpr5母源蛋白对心脏发育的影响。结果表明,降解Mpr5母源蛋白导致胚胎心脏出现明显的发育缺陷。为了探讨Mpr5蛋白是否作为泛素化底物参与泛素化调控机制,对Mpr5蛋白作用的泛素化E3连接酶进行预测,发现其与TP53关系密切。随后利用Co-IP发现Mpr5与组成泛素连接酶复合物Skp1在细胞内具有相互作用。这些结果提示Mpr5蛋白可能作为泛素化底物参与泛素--蛋白酶体系从而调控斑马鱼心脏发育。同时,实验室早期研究表明Foxp4起调控心脏发育作用,而Mpr5调控Foxp4基因表达的同时Foxp4调控Tcap的表达,于是提出Mpr5-Foxp4-Tcap信号通路调控心脏发育的假设。本文利用Chip实验发现Mpr5主要结合在Foxp4基因启动子ATG上游-266～-626区域,初步表明Mpr5蛋白通过调控Foxp4基因的表达参与斑马鱼心脏发育的调控。随后,本文探讨了Tcap基因在心脏发育中的作用。首先利用p Tol2-cmlc2-IRES-EGFP质粒构建Tcap基因斑马鱼过表达品系,在F0代筛选有心脏特异性表达绿色荧光蛋白的个体,发现胚胎心脏出现明显的心包增大的畸形表型,提示Tcap基因可能控制斑马鱼心脏发育。随后应用Trim-Away技术对Tcap蛋白进行降解,研究结果发现Tcap蛋白降解导致斑马鱼心脏严重畸形,表明Tcap基因控制胚胎心脏发育。同时利用Co-IP实验未能检测出二者在细胞内的相互作用。这些研究结果支持实验室的前期假设,即Mpr5基因位于调节信号通路的上游,通过Foxp4基因调控斑马鱼心脏发育,而Tcap基因可能位于信号通路的下游。总之,本文利用降解目标蛋白的新技术探讨了Mpr5和Tcap基因在斑马鱼心脏发育中的作用,同时表明Trim-Away技术是研究调控早期胚胎发育蛋白功能的一种行之有效的新技术。同时,本文利用分子生物学技术进一步研究了Mpr5,Foxp4和Tcap基因之间的关系,初步结果提示Mpr5,Foxp4和Tcap基因可能形成一条信号通路调控心脏的分化和发育,该研究结果为深入研究这些基因的功能和调控机制奠定了基础。