目的：　　通过培养正常大鼠肝细胞，建立肠外营养相关性肝病（parenteral nutrition associated liver disease，PNALD）细胞模型—肝细胞脂肪变模型，以内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的关键信号通路IRE1α/XBP1信号通路为切入点，并通过IRE1α核酸内切酶特异性抑制剂STF-083010干预PNALD肝细胞脂肪变模型，在前期研究基础上，进一步探讨内质网应激在PNALD肝细胞脂肪变中的作用机制，试图在细胞水平为临床预防和治疗PNALD提供新的思路和实验依据。　　方法:　　将BRL肝细胞随机分为对照组和实验组。对照组用正常培养基培养，实验组用含有脂肪乳剂的培养基培养。实验组在细胞状态相同的条件下加入用培养基稀释的不同浓度医用20%脂肪乳注射液（浓度分别为0.4%、1%、2%、4%），根据细胞活性和形态学，确定了含1%脂肪乳的培养基培养肝细胞细胞活性较高，且肝细胞内脂滴明显，可作为建立脂肪变肝细胞离体模型的最佳浓度。　　按上述方案，分别在0h、12h、24h、36h收集肝细胞，采用CCK-8检测细胞增殖、采用油红O染色观察细胞内脂肪滴形成及细胞形态变化、采用逆转录-多聚酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测PNALD肝细胞脂肪变模型内GRP78、IRE1α、sXBP1、JNKmRNA的动态表达水平、采用蛋白质印迹法（Western blot）技术检测PNALD肝细胞脂肪变模型内GRP78、IRE1α、p-IRE1α、sXBP1、JNK、p-JNK蛋白动态表达水平。　　设置不同浓度梯度的STF-083010抑制剂（0、10、25、50、75、100、125μM）（设为A（对照）、B、C、D、E、F、G组）干预PNALD肝细胞脂肪变模型（脂肪乳浓度均为1%），在肝细胞培养24h对用不同浓度抑制剂干预的肝细胞行CCK-8法检测细胞活性，同时采用RT-PCR法检测不同浓度抑制剂干预的肝细胞sXBP1 mRNA表达水平，确定细胞活性较高并且与1%脂肪乳组肝细胞内sXBP1 mRNA表达明显降低、能有效抑制IRE1α核酸内切酶活性的浓度进行后续实验。　　最终将 BRL细胞随机分成四组：空白对照组（ CON组）、豆油脂肪乳（soybean-based lipid emulsion，SLE）组（SLE组）、豆油脂肪乳+二甲基亚砜溶剂对照组（SLE+DMSO组）、豆油脂肪乳+STF-083010抑制剂组（SLE+STF组）。其中CON组用RMPI培养基培养，其余三组脂肪乳浓度均为1%，STF抑制剂浓度为50μM。在细胞培养24h后分别收集四组细胞,采用全自动生化仪检测四组细胞培养液的生化指标、采用RT-PCR法检测PNALD肝细胞脂肪变模型内GRP78、IRE1α、sXBP1、JNK mRNA的表达、采用Western blot技术检测PNALD肝细胞脂肪变模型内GRP78、IRE1α、p-IRE1α、sXBP1、JNK、p-JNK蛋白表达水平。　　结果：　　1.肝细胞脂肪变造模脂肪乳浓度确定　　1.1.CCK-8法检测细胞增殖：与CON组相比，0.4%、1.0%脂肪乳组细胞OD值无明显下降（P＞0.05）；2.0%、4.0%脂肪乳组细胞OD值显著下降（P＜0.05）。各浓度脂肪乳组之间24h细胞OD值差异有统计学意义（P＜0.05）。　　1.2.各浓度脂肪乳组肝细胞形态观察：CON组细胞形态正常，细胞间结合紧密，细胞内无红色脂滴出现；0.4%脂肪乳组部分肝细胞开始出现少量脂滴；1.0%脂肪乳组肝细胞形态仍正常，细胞间结合仍紧密，细胞内可见较多红色脂滴；2.0%、4.0%脂肪乳组肝细胞内可见大量脂肪变细胞，脂滴呈环状位于细胞膜内侧，细胞肿胀，细胞数量减少。　　1.3.细胞培养液生化指标：TBIL、DBIL、ALP、LDH在各浓度组间比较无显著差异（P＞0.05）；而AST、ALT、TG、GGT在各浓度组间比较差异显著（P＜0.05）。与CON、0.4%脂肪乳组相比，1%、2%、4%脂肪乳组AST、ALT、TG均明显升高（P＜0.05），2%、4%脂肪乳组ALB显著下降（P＜0.05），4%脂肪乳组GGT明显升高（P＜0.05）。　　2.造模后脂肪变肝细胞形态、活力、ERS相关信号分子GRP78、IRE1α、sXBP1、JNK mRNA及蛋白表达水平的动态观察　　2.1.CCK-8法检测各时间点细胞增殖：1.0%脂肪乳组细胞OD值在12h、24h较0h无明显下降（P＞0.05），36h细胞OD值较0h相比下降明显（P＜0.05）。　　2.2.1%脂肪乳组肝细胞形态动态观察：观察时间内（0、12、24、36h）细胞形态正常，细胞间结合紧密，随时间延长，细胞内红色脂滴增多，脂肪滴变大，细胞核边缘模糊。　　2.3.各时间点肝细胞内GRP78、IRE1α、sXBP1、JNK mRNA的动态表达　　用1%脂肪乳培养正常大鼠BRL肝细胞，GRP78 mRNA在四个时间点（0、12、24、36h）逐渐升高，各时间点之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。IRE1α mRNA在12h开始升高，但36hIRE1α mRNA表达较24h比较无明显升高（P＞0.05）。sXBP1 mRNA在12h表达也开始升高，但24h达峰值后，在36h其表达明显下降，较24h比较差异有统计学意义（P＜0.05）。JNK mRNA在24h开始升高，较0h、12h差异有统计学意义（P＜0.05），36h JNK mRNA较24h明显升高（P＜0.05）。　　2.4.各时间点肝细胞内GRP78、IRE1α、p-IRE1α、sXBP1、JNK、p-JNK蛋白的动态表达　　用1%脂肪乳培养正常大鼠BRL肝细胞，GRP78蛋白在四个时间点（0、12、24、36h）逐渐升高，12、24、36h与0h相比差异均有统计学意义（P＜0.05）；36h GRP78蛋白表达与12、24h比较，有显著差异（P＜0.05）。IRE1α蛋白表达在四个时间点间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而p-IRE1α蛋白表达在四个时间点间比较，差异显著（P＜0.05），24、36h其蛋白表达水平较12h均明显升高（P＜0.05），但36h蛋白表达较24h无明显升高（P＞0.05）。sXBP1蛋白表达在12h开始升高，24h达高峰后呈下降趋势，36h其表达明显低于24h（P＜0.05）。JNK蛋白表达在四个时间点间无显著差异（P＞0.05），而p-JNK蛋白36h出现升高，且较前三个时间点（0、12、24h）均显著升高（P＜0.05）。　　3.STF-083010抑制剂作用浓度的确定　　3.1.CCK-8法检测细胞增殖：除B组外，其余各组与A组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。除 G、F两组间比较差异不明显（P＞0.05），其余各浓度抑制剂组组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。　　3.2.各组sXBP1 mRNA的表达：24h细胞sXBP1 mRNA表达在各组之间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。除B组外，其余各组与 A组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。D、E、F组肝细胞sXBP1 mRNA表达较C组明显下降（P＜0.05）。结果显示50μM抑制剂组肝细胞sXBP1 mRNA表达降低明显，细胞活性能满足后续实验的需要。　　4.STF-083010抑制剂对PNALD肝细胞脂肪变模型的影响　　4.1.四组肝细胞培养上清液生化比较：四组肝细胞之间比较 AST、ALT、LDH、TG均有显著差异，有统计学意义(P<0.05)，而 TBIL、DBIL、ALB、ALP、GGT均无明显差异(P>0.05)。SLE+STF组AST、ALT显著高于其他三组，CON组LDH、TG显著低于另三组(P<0.05)。　　4.2.24h四组肝细胞GRP78、IRE1α、sXBP1、JNK mRNA表达水平　　4.2.1.四组肝细胞GRP78 mRNA表达水平：SLE、SLE+DMSO、SLE+STF三组肝细胞GRP78 mRNA表达在24h较CON组均明显升高（P＜0.05），而这三组间两两比较均无显著差异（P＞0.05）。　　4.2.2.四组肝细胞IRE1α mRNA表达水平：SLE、SLE+DMSO、SLE+STF三组肝细胞IRE1α mRNA较CON组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其余各组两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。　　4.2.3.四组肝细胞sXBP1 mRNA表达水平变化：SLE、SLE+DMSO、SLE+STF三组肝细胞sXBP1mRNA较CON组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；SLE+DMSO组较 SLE组差异无统计学意义（ P＞0.05）；SLE+STF组sXBP1mRNA表达较SLE+DMSO组明显下降（P＜0.05）。　　4.2.4.四组肝细胞JNK mRNA表达水平变化：SLE、SLE+DMSO、SLE+STF三组肝细胞JNK mRNA较CON组比较差异有统计学意义（P＜0.05），SLE+STF组JNKmRNA表达较SLE+DMSO组明显升高（P＜0.05）。　　4.3.24h四组肝细胞GRP78、IRE1α、p-IRE1α、sXBP1、p-JNK蛋白表达水平比较　　4.3.1.四组肝细胞GRP78蛋白表达水平水平比较：24h细胞GRP78蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。SLE、SLE+DMSO、SLE+STF三组肝细胞GRP78蛋白表达较CON组均明显升高（P＜0.05），其余三组之间相互比较差异无统计学意义（P＞0.05）。　　4.3.2.四组肝细胞IRE1α、p-IRE1α蛋白表达水平水平比较：24h细胞IRE1α蛋白表达在四组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），p-IRE1α蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。SLE、SLE+DMSO、SLE+STF三组肝细胞p-IRE1α蛋白表达较CON组均明显升高（P＜0.05），其余三组之间相互比较差异无统计学意义（P＞0.05）。　　4.3.3.四组肝细胞sXBP1蛋白表达水平水平比较：24h细胞sXBP1蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。SLE、SLE+DMSO、SLE+STF三组肝细胞内sXBP1蛋白表达较CON组均明显升高（P＜0.05），SLE+DMSO组与SLE组相比差异不明显（P＞0.05），SLE+STF组sXBP1蛋白表达与SLE+DMSO组相比下降明显（P＜0.05）。　　4.3.4.四组肝细胞JNK、p-JNK蛋白表达水平水平比较：24h细胞JNK、p-JNK蛋白表达在四组之间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。　　结论：　　1.本实验成功建立了大鼠 PNALD—肝细胞脂肪变模型，为初步研究 PNALD发病机制奠定了基础；　　2.SLE组脂肪变肝细胞中 GRP78和 IRE1α/XBP1/JNK信号通路中相关分子p-IRE1α、sXBP1、p-JNK蛋白及IRE1α、sXBP1、JNK mRNA表达随造模时间延长逐渐升高，提示ERS时IRE1α/XBP1s/JNK信号通路可能参与了PNALD脂肪变肝细胞的发生、发展。