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研究背景重度烧伤对机体属于一个致命性打击,重度烧伤后大量组织坏死,伴随明显的应激、休克、营养缺乏及感染。在重度烧伤休克期,严重的热力损伤会导致嗜中性粒细胞,巨噬细胞,单核细胞,淋巴细胞和自然杀伤细胞释放细胞因子不仅参与机体防御反应,还能作用于正常的细胞与组织。重度烧伤不仅损伤了皮肤的功能,临床上甚至可以诱发全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponse syndrome,SIRS)及多器官功能衰竭(multiple organ failure,MOF)。能否平稳的度过重度烧伤休克期被视为治疗的关键时期,但重度烧伤休克期潜在的病理机制尚不明确。外泌体是一种细胞通过主动分泌并排出胞外的囊性小泡,其本质是脂质双分子层,内含物大部分是蛋白质、miRNA及mRNA,在细胞间的物质传递及信息交流发挥重要作用。目前越来越多证据表明,外泌体内的miRNA可以通过作用于靶基因调节相关的疾病的病理过程,本课题组从血清中外泌体的角度对重度烧伤休克期进行病理生理分子机制方面的研究。研究目的证明重度烧伤后大鼠血清中外泌体的存在,并进行形态学特征的相关鉴定,获得重度烧伤后24h组与重度烧伤后48h组的外泌体差异miRNA表达谱,通过对差异表达的miRNA的靶基因进行生物信息学分析,加深对重度烧伤休克期病理生理分子机制方面的认识,探索外泌体是否具有重度烧伤诊断标志物的潜能,为疾病的分子靶向治疗提供新方向。研究方法1.重度烧伤大鼠动物模型的建立及标本采集:根据随机分组原则将大鼠分为重度烧伤实验组与假烫伤组进行外泌体鉴定,每组各1只。此外,再随机将1 8只大鼠分为一个假烫伤组,两个实验组用于外泌体测序:空白对照组(sham组[n=6]);重度烧伤休克早期组(重度烧伤后24h组[n=6]);重度烧伤休克晚期组(重度烧伤后48h组[n=6])。其中实验组中的SD大鼠(雄性;200-220g;2月龄)背部剃毛后皮肤浸入97℃的恒温水箱中暴露15s建立Ⅲ度烧伤模型,假烫伤组的大鼠浸入37℃的恒温水箱中15s建立假烫伤模型,烧伤面积占总面积的20%。从大鼠的眼静脉收集血液,不同组别根据各自对应的时间点进行采血,采血结束后分离出血清进行冷冻保存。2.外泌体的提取及鉴定:使用试剂盒对所有血清样本中的外泌体进行提取,分别对假烫伤组与重度烧伤实验组的大鼠血清中的外泌体进行鉴定。通过透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)、纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)、蛋白质印迹技术(western blotting,WB)对外泌体的存在进行验证。3.外泌体中的miRNA进行二代测序:先提取出外泌体的总RNA,接着进行miRNA建库,且对文库进行质量检测。使用Illumina Hiseq2500测序系统获得差异性表达miRNA的表达谱,对差异表达的miRNA进行分析及靶基因预测。4.差异性表达miRNA靶基因的功能富集分析:获得各组的差异性miRNA表达谱后,对其靶基因进行GO(GO Ontology,基因本体论)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)生物信息学分析。5.蛋白互作网络功能构建:通过STRING数据库分析了最显著共同差异表达miRNA的靶基因,以构建蛋白互作网络图(Protein-protein interaction network,PPI),并使用Cytoscape进行可视化。使用MCODE模式从该网络图中修剪和识别核心模块。6.RT-PCR的验证:挑选实验组中共同差异性表达的miRNA进行验证,检验二代测序实验结果的准确性。7.统计学分析方法:采用单因素方差分析,选取双尾范围,p值<0.05,计算得出假烫伤组,重度烧伤后24h组和重度烧伤后48h组之间miRNA表达的差异。研究结果:1.在重度烧伤实验组与假烫伤组的大鼠血清中成功分离出了外泌体,在透射电镜下观察到典型的双凹圆盘状;重度烧伤实验组外泌体的平均粒径为192.8±65nm,假烫伤组外泌体的平均粒径为169.6±59.2nm;重度烧伤实验组WB实验示CD63,CD81和HSP70等蛋白表达阳性,假烫伤组中CD9,CD63,CD81等蛋白表达阳性。2.相比于sham组,重度烧伤后24h组检测出有34个差异性表达的miRNA,重度烧伤后48h组有63个。当P<0.005及log2(foldchange)|≥1时,重度烧伤后整个休克期 miRNA-339-5p,miRNA-206,miRNA-378d,miRNA-1,miRNA134-5p,and miRNA-365a-5p较sham组均显著差异性表达。3.GO功能富集分析示重度烧伤休克期差异表达miRNA的靶基因主要与细胞过程、新陈代谢过程、生物调控、细胞免疫系统相关;KEGG通路分析示自然杀伤细胞介导的细胞毒性、B细胞受体信号通路、轴突导向通路、丙酮酸代谢通路、长时程增强效应信号通路、2型糖尿病通路及肿瘤蛋白聚糖通路显著增强。研究结论:1.证明重度烧伤后大鼠血清中外泌体的存在,通过对外泌体测序及分析获得了重度烧伤休克期外泌体差异miRNAs的表达谱。2.重度烧伤休克早期与晚期,外泌体差异表达的miRNA也不尽相同。3.重度烧伤后差异表达miRNA的靶基因生物信息学分析证明重度烧伤后机体存在免疫功能紊乱。4.MiRNA-206,miRNA-223-5p和miRNA-1可能是早期诊断重度烧伤引起的 SIRS 及 MOF 的标志物,let-7 家族的 miRNA,miRNA-122,miRNA-21,miRNA-223可能是重度烧伤后引起高血糖反应的相关miRNAs,后期可能成为新的治疗靶点。