蛋白磷酸酶2A通路缺失导致前列腺肿瘤细胞转化生长因子beta的过分泌

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[研究背景]转化生长因子Beta (TGFβ)是一种多功能生长调节因子,自1981年被发现以来,已被证实参与胚胎发育、肿瘤形成、血细胞生成、纤维化、创伤愈合和免疫调节等多种生物学过程。其中,在肿瘤发生的早期阶段,TGFβ延续了其基态下的生长抑制功能而具有肿瘤抑制因子的作用,但在肿瘤发展的后期,该信号通路中的一些成员发生异常改变或功能缺陷,包括细胞周期蛋白基因、TGFβ受体以及Smads基因突变或缺失等,均可导致细胞能够抵抗TGFβ的生长抑制而产生不受控制的细胞增殖,当细胞对TGFβ的生长抑制信号失去反应时,肿瘤细胞自身会反馈性的增加TGFβ的分泌,此时大量的TGFβ不仅无法发挥生长抑制作用,反而可促进肿瘤细胞与胞外基质的相互作用、血管内皮细胞增生和肿瘤内血管的形成,同时抑制免疫细胞的活性使肿瘤细胞逃过免疫系统的监控,给肿瘤的生长和转移提供合适的微环境,因此进展期肿瘤细胞大量分泌TGFβ成为肿瘤进展的一个恶性循环链。研究表明,前列腺癌中TGFβ表达水平较正常前列腺组织明显增高,TGFβ的高表达,往往与临床预后不良有关。如果能够打破肿瘤细胞高分泌TGFβ这个恶性循环链,将有可能抑制肿瘤的进展。打破这个恶性循环链的一个前提条件是要探索出肿瘤细胞分泌大量TGFβ的机制。TGFβ最强的诱导因子是其自身,即自身诱导。本实验主要探究在正常和恶性前列腺癌细胞中,TGFβ的自身诱导有无差异,从而导致TGFβ分泌水平的不同,为抑制肿瘤细胞依赖高分泌TGFβ进展建立基础。[目的](1)检测良、恶性前列腺细胞TGFβ分泌水平的差异;(2)分析TGFβ自身诱导在良、恶性前列腺细胞TGFβ分泌差异中的作用;(3)探讨在良、恶性前列腺细胞中TGFβ自身诱导差异的机制。[方法](1)用酶联免疫吸附(ELISA)测定前列腺恶性肿瘤PC3、DU145,良性前列腺增生BPH1和正常前列腺上皮细胞RWPE1等四种不同细胞株上TGFβ分泌水平的差别;(2)通过用TGFβ中和受体1D11,或者将四种细胞系转染包含TGFβ竞争性抑制受体的逆病毒来阻断内源性TGFβ,然后再测量这四种细胞株的TGFβ分泌水平,从而判断内源性TGFβ对其自身水平维持的作用;(3)用不同剂量外源性TGFβ(低剂量0.1ng/ml;高剂量lOng/ml)刺激这四种细胞株,用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测诱导的内源性TGFβ转录水平,从而判断外源性TGFβ对维持内源性TGFβ水平的作用;(4)用Western-blot检测四种细胞株给予外源性TGFβ刺激后,胞外信号调节激酶(ERK)活化水平的变化,用U0126阻断ERK后,观察四种细胞株中TGFβ自身诱导的变化;(5)测量四种细胞株给予不同剂量TGFβ诱导后,酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PPP)活性的变化;(6)用免疫共沉淀(co-IP)检测不同细胞株给予TGFβ刺激后TGFβ受体Ⅰ(TBRI)和蛋白酶2A (PP2A)结合量的变化。用冈田酸(OA)抑制PP2A活性后,观察给予不同剂量外源性TGFβ, ERK及内源性TGFβmRNA水平的变化。[结果](1)前列腺肿瘤细胞分泌的TGFβ比正常前列腺细胞高;(2)阻断内源性TGFβ后,在前列腺良性细胞TGFβ转录水平无明显变化,恶性细胞系中TGFβ转录水平降低;(3)低剂量的外源性TGFβ,能够在四种细胞株中诱导内源性TGFβ的产生;但高剂量的TGFβ,只能在前列腺恶性细胞中诱导内源性TGFβ的产生。(4)给予低剂量外源性TGFβ,在四种细胞株中,ERK的活化水平都上升,给予高剂量TGFβ刺激,在恶性前列腺癌细胞中,ERK活化继续上升,但在良性前列腺癌细胞,ERK活化水平下降。阻断ERK通路,在四种细胞株中,TGFβ自身诱导都被阻断;(5)在良性前列腺癌细胞,给予外源性TGFβ刺激,其丝/苏氨酸蛋白磷酸酶活性和TBRI/PP2A结合呈剂量依赖性上升,在恶性前列腺癌细胞中,酶活性保持不变;用OA抑制PP2A活性后,给予不同剂量外源性的TGFβ,ERK活性和内源性TGFβ转录水平都增加。[结论](1)TGFβ在恶性前列腺上皮细胞中高于恶性前列腺上皮细胞中,这种表达水平的差异部分源于在良、恶性细胞中TGFβ自身诱导的差异,即在恶性良性细胞中TGFβ的自身诱导失控,而良性前列腺细胞中自身诱导只用TGFβ在一定浓度范围内时才存在;(2)在良、恶性前列腺上皮细胞中,TGFβ自身诱导的差异是由于ERK通路的差异;(3)在良、恶性前列腺上皮细胞中ERK通路的差异源于在恶性细胞中PP2A通路的缺失。
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