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该课题的研究主要分为以下几个部分:第一部分ACAID模型的诱导.目的:分别以IRBP和BSA诱导ACAID,比较不同抗原诱导的ACAID有无差异,并为以下的研究提供了动物模型.方法:全麻动物,显微镜下以30号前房穿刺针头穿刺角膜形成通道,分别注入前房5μl(10μg/μl)IRBP和BSA溶液诱导ACAID;对正常大鼠和前房注射抗原后3、7、14、28、42、60、120d的大鼠分别以抗原免疫,7d后右耳廓皮内注射抗原10μl(1μg/μl)以诱导DTH,利用DTH来检测ACAID的形成.结论:前房注射从牛视网膜提取的IRBP和非特异型抗原BSA 7d后,均可诱导出ACAID,且两种抗原诱导情况基本无差异,说明ACAID的诱导并不需要眼内特异型抗原,同时ACAID的诱导成功也为以下的实验提供了稳定的动物模型.第二部分ACAID形成过程中脾脏GATA-3表达及细胞因子分泌.目的:了解ACAID中GATA-3蛋白和基因的表达及细胞因子分泌.方法:(1)于前房注射IRBP后3、7、14、28、42、60、120d分别处死动物,取其脾组织,用AEC法进行免疫组织化学染色,观察GATA-3阳性染色细胞的分布;(2)行TMB westem免疫印迹,每组6只鼠,实验重复3次.(3)取其脾组织,采用Trizol一步法从脾组织中提取总RNA,利用特异引物及RT-PCR扩增GATA-3及内对照-β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA,GATA-3上游引物:5ccgtcc tac tac gga aac tcg gtc 3,下游引物:5agttca cac act ccc tgc ctt ctg 3,扩增片段长度为618bp;β-actin基因上游引物:5gcc atc ctg cgt ctg 3,下游引物:5ggg gcatcg gaa ccg ct 3,扩增片段长度为254bp.将扩增产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳,保存电泳图谱,每组6只鼠,实验重复3次.(4)取上述脾组织的cDNA产物,应用荧光定量PCR进行GATA-3表达的定量检测.(5)取其脾组织,制成单个细胞悬液,采用流式细胞直接免疫荧光标记法,检测脾脏淋巴细胞上GATA-3的表达,每组6只鼠,实验重复3次.(6)取动物心脏全血,离心后取其血清,用ELISA法检测细胞因子IL-4、IFN-γ的分泌水平,每组6只鼠,实验重复3次.(7)取动物心脏全血,经淋巴细胞分离液处理和密度梯度离心后得到单个核细胞,在有或无特异型抗原刺激下培养24~48小时后,采用ELISA法检测培养上清中细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-12的分泌情况,每组6只鼠,实验重复3次.结论:前房注射IRBP或BSA 3d后,脾组织中GATA-3蛋白和mRNA表达显著增加,并且早于ACAID的形成时间(7d),提示GATA-3可能参与了ACAID的形成;ACAID形成后有大量IL-4分泌,而IFN-γ和IL-12水平明显降低,提示ACAID是依赖Th2细胞的免疫应答.第三部分GATA-3基因正义、反义表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达.目的:构建GATA-3基因正义、反义重组质粒,为进一步研究GATA-3在T细胞发育分化中的作用提供基础.方法:采用PCR技术扩增GATA-3基因,通过酶切、连接、转化等分子生物学技术,将该全长基因亚克隆至表达载体pCDNA3,构建质粒后转染大肠杆菌,并在大肠杆菌中扩增.同时用脂质体法感染大鼠脑细胞.结论:通过基因克隆方法成功构建了GATA-3基因正义、反义表达质粒,并初步证实反义GATA-3具有抑制细胞正常表达作用,为深入研究GATA-3对T细胞发育分化的影响奠定了基础.小结:通过该课题的研究,从分子水平和细胞因子水平进一步证实了Th2 CD4<+>T细胞的激活是ACAID形成所必需的,并提示GATA-3参与了ACAID的形成过程中Th2的分化发育;该课题还成功构建了GATA-3基因正义、反义表达质粒,为深入研究该基因对Th2细胞发育分化的影响提供基础.