藏系绵羊胎盘肽的制备及其抗氧化能力研究

来源 :兰州理工大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:lwl45789
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我国羊胎盘资源相对丰富,且具有很好的营养和药用价值,对其加工利用制备为羊胎盘制品或酶解制备功能活性肽,可实现其高值化利用。本文通过以藏系绵羊胎盘为原料,利用超声波辅助复合酶解法制备抗氧化肽,通过多种体外评价法测定其抗氧化能力,采用傅里叶红外光谱、扫描电镜、X射线衍射和圆二色谱等方法对其蛋白质的二级结构进行表征,经Sephadex G-15凝胶色谱柱对羊胎盘肽进行分离纯化,并用纳升液相质谱法测定目标肽段的氨基酸序列。主要研究结果如下:(1)通过凯氏定氮法、索式抽提法和高效液相色谱法对羊胎盘的基本组成成分进行测定。结果表明,羊胎盘是一种高蛋白(87.50%)、低脂肪(5.23%)及富含必需氨基酸(26.36%)和抗氧化氨基酸(13.25%)的较理想原料。在此基础上,以水解度、肽得率和抗氧化能力为指标,首先进行蛋白酶种类筛选及双酶组合方案的确定,再进一步利用单因素和响应面试验优化超声波辅助复合酶解制备羊胎盘肽的工艺条件,并对其氨基酸组成及相对分子质量分布进行分析。研究表明,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶同步复合酶解的水解效果优于其他蛋白酶组合,水解度和肽得率分别为37.24%和13.54%。响应面优化结果显示各因素对水解度影响的主次顺序为:超声时间>超声温度>酶解时间>超声功率,优化后的最优工艺参数为超声时间16.5 min,超声温度25.5℃,酶解时间4.9 h,超声功率438 W。该最优条件下的水解度为55.22%,肽得率为18.52%,抗氧化能力为1.08 mM(相当1.08 mM VE)。(2)采用自由基清除能力、金属离子螯合能力和还原能力等方法分析不同浓度羊胎盘肽的抗氧化能力,并结合分子质量分布、氨基酸组成和结构表征分析来探讨羊胎盘肽的抗氧化能力成因。结果表明,藏系绵羊胎盘肽的抗氧化能力与其质量浓度呈正相关,DPPH自由基和羟基自由基清除能力较强,IC50分别为2.83 mg/mL和0.94 mg/mL,与BHT能力相当;还具有一定清除超氧阴离子自由基的能力、螯合Fe2+能力和Fe3+、Cu2+还原能力。羊胎盘肽中相对分子质量低于1000 Da的寡肽含量占比接近90%,富含Glu、Gly、Asp等氨基酸。结构表征显示,羊胎盘肽仍保留有源蛋白的特征官能团,微观形貌呈致密的球状颗粒,蛋白降解为肽的过程中分子发生重排和聚集,α-螺旋减少,β-折叠和无规卷曲等二级结构增加。总之,适宜的小分子寡肽含量、氨基酸组成、特殊的微观形貌及空间结构赋予藏系绵羊胎盘肽良好抗氧化能力。(3)采用凝胶色谱法对羊胎盘肽进行分离纯化,并通过纳升液相四级杆轨道阱质谱(Easy nLC1200-Q Eaxtive plus)对活性组分中的肽段进行序列鉴定。结果表明:羊胎盘肽经Sephadex G-15分离后共得到F-1、F-2、F-3及F-4四个组分,其中F-2组分抗氧化能力最强,对DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率及Fe3+还原能力分别为19.61%、0.56 mM及0.05,最终在组分F-2中鉴定出27条肽段。
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