子宫内膜异位症（内异症）是一种常见而棘手的妇科疾病，大约有10％-15％的育龄妇女患此病。由于目前尚缺乏对子宫内膜异位症发生发展的确切分子机制的了解，严重阻碍了该疾病有效预防和治疗的发展。　　MiR-199a是较早发现的人类miRNA之一，具有调控细胞增殖、侵袭、转移等作用，其在多种肿瘤中异常表达并与肿瘤的发生发展密切相关。但其与子宫内膜异位症发生发展的关系及其对子宫内膜细胞生物学行为的影响研究甚少。本课题从研究miR-199a在正常子宫内膜、内异症患者在位内膜和异位内膜中的表达入手，利用脂质体转染技术提高子宫内膜间质细胞中miR-199a的表达，并运用PCR、westernblot、CCK-8、划痕实验、体外移动和侵袭实验、微管形成实验，荧光报告基因实验等探讨miR-199a在子宫内膜间质细胞黏附、迁移、侵袭和促血管形成过程中的作用。我们的实验结果提示:miR-199a在内异症患者在位内膜和异位内膜中的异常表达及其作用可能是影响子宫内膜间质细胞生物学行为的重要因素之一。　　本课题共分四个部分:①miR-199a在子宫内膜异位症在位与异位内膜组织中的表达;②子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞的分离及培养;③miR-199a对子宫内膜间质细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响;④miR-199a对子宫内膜间质细胞促血管形成能力的影响。　　第一部分miR-199a在子宫内膜异位症在位与异位内膜组织中的表达　　目的:检测miR-199a在正常子宫内膜、内异症患者在位内膜、内异症患者异位内膜组织中的表达，探讨miR-199a与内异症的关系。　　方法:利用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-199a在正常子宫内膜、内异症患者在位内膜、内异症患者异位内膜组织中的表达，并比较它们之间的表达差异。　　结果:miR-199a在正常内膜组织中的表达水平显著高于内异症患者的在位内膜组织，两组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);并且miR-199a在内异症患者在位内膜组织中的表达水平显著高于该患者的异位内膜组织，两组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。　　结论:miR-199a的异常表达可能与内异症的发生有关。　　第二部分子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞的分离及培养　　目的:通过分离、培养子宫内膜细胞建立子宫内膜异位症体外模型。　　方法:收取子宫内膜标本，根据子宫内膜间质细胞与腺上皮细胞在大小、沉降速率及黏附能力的差异，通过酶解、过滤、沉降及贴壁纯化的方法进行子宫内膜间质细胞的分离培养。并通过免疫组化法鉴定细胞纯度。　　结果:成功分离培养子宫内膜间质细胞，细胞纯度达95％以上，并且可在体外有限传代。　　结论:子宫内膜间质细胞的分离培养可一定程度上在体外模拟内异症。　　第三部分MiR-199a对子宫内膜间质细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响　　目的:探讨miR-199a对子宫内膜间质细胞黏附、迁移和侵袭能力的调控作用及其相关机制。　　方法:采用脂质体转染技术将体外合成的miRNA阴性对照(NC)和成熟的miR-199a模拟物(mimics)转染入子宫内膜间质细胞。利用黏附实验、划痕实验、迁移实验以及重组细胞基底膜侵袭实验分别检测miR-199a转染后子宫内膜间质细胞的体外黏附能力，迁移能力以及侵袭力的变化。运用荧光素酶报告基因实验验证在子宫内膜间质细胞中miR-199a的靶基因之一是核因子-(κ)B抑制蛋白激酶β(IKKβ)。利用蛋白免疫印迹法检测miR-199a对IKKβ、核因子-κB抑制蛋白α(IκB-α)、磷酸化IκB-α(p-IκB-α)和核因子-κB(NF-κB)蛋白的调控作用。运用免疫荧光染色法观察miR-199a转染后NF-κB核转移过程的变化。应用ELISA法检测miR-199a转染后子宫内膜间质细胞白介素8(IL-8)分泌量的改变。　　结果:(1)细胞体外黏附能力:miR-199a转染组细胞的黏附抑制率为(13.73±4.43)％，高于对照组(0)，两组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);(2)细胞迁移和侵袭能力:划痕实验显示，miR-199a组细胞体外培养48小时后划痕愈合程度低于NC组。迁移实验显示:与NC组相比较，miR-199a组的跨膜细胞显著减少(P＜0.01)。侵袭实验显示:与NC组相比较，miR-199a组穿透基底膜细胞显著减少(P＜0.01)，(3)报告基因实验:与NC组相比较，miR-199a组的荧光素酶的表达水平显著降低。两组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。(4)蛋白表达:与转染NC的细胞（蛋白表达水平设定为1.00）相比，转染miR-199a的细胞中IKKβ、p-IκB-α、IκB-α和NF-κB蛋白的表达水平分别为0.350±0.195、0.443±0.076、1.970±0.486和0.454±0.147。两组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)。(5)免疫荧光染色显示:与NC组相比较，miR-199a组细胞核内荧光染色强度明显降低。两组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。(6)与NC组相比较，miR-199a转染组IL-8蛋白分泌水平明显降低。两组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。　　结论:miR-199a能抑制人子宫内膜间质细胞的黏附、迁移和侵袭力。IKKβ为miR-199a的靶基因。miR-199a抑制子宫内膜间质细胞侵袭能力的机制之一可能是通过调控靶基因IKKβ，抑制NF-κB通路的活化水平。　　第四部分MiR-199a对子宫内膜间质细胞促血管形成能力的影响　　目的:探讨miR-199a对子宫内膜间质细胞促血管生成能力的调控作用及其相关机制。　　方法:用缺氧条件下子宫内膜间质细胞NC或miR-199a转染组的上清液培养人脐静脉内皮细胞融合细胞EA.hy926，采用CCK-8实验、迁移实验、侵袭实验、微管形成实验检测EA.hy926细胞的增殖、移动、侵袭和血管新生能力。应用ELISA法检测子宫内膜间质细胞培养上清液中IL-8和血管内皮生长因子(VEGF)的分泌水平。运用荧光素酶报告基因实验验证在子宫内膜间质细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和VEGF-A是miR-199a的靶基因。　　结果:(1)缺氧环境下miR-199a转染组子宫内膜间质细胞培养上清液能显著抑制人脐静脉细胞融合细胞株EA.hy926的体外增殖、迁移、侵袭及微管形成能力(P＜0.01)。(2)缺氧状态下，miR-199a转染组VEGF、IL-8蛋白的分泌水平低于NC组。两组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。(3)以HIF1A为靶点的荧光报告基因实验显示:miR-199a转染组的荧光素酶表达水平显著低于NC转染组。两组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。(4)以VEGFA为靶点的荧光报告基因实验显示:miR-199a转染组的荧光素酶的表达水平显著低于NC转染组。两组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。　　结论:miR-199a能抑制人子宫内膜间质细胞的促血管生成能力。在该细胞中，HIF1A和VEGFA为miR-199a的靶基因。miR-199a抑制子宫内膜间质细胞促血管生成能力的机制之一可能是通过调控靶基因HIF1A和VEGFA，抑制促血管生成因子VEGF，IL-8等的表达。