镉是环境污染物中常见的有毒重金属,肾脏是镉慢性中毒的主要靶器官,长期暴露可导致不可逆的肾功能损伤。近些年来,镉诱导肾细胞凋亡已成为各国学者对镉分子机理的一个研究热点,而且镉引起的氧化应激已被认为是其诱导细胞凋亡的重要机制。大量研究表明,镉可以引起细胞的氧化损伤,超氧化物歧化酶(SOD)下降,脂质过氧化物产物丙二醛(MDA)上升及耗竭细胞内的谷胱甘肽,并发现采用抗氧化剂可对镉引起的氧化损伤具有一定的保护作用,但对于其作用机制尚未完全明确。由线粒体介导的内源途径是生物体内存在的与氧化应激密切相关的一条凋亡途径,对细胞增值,存活及死亡具有重要的调节作用,因而研究该通路能否在镉诱导细胞凋亡过程中被激活具有重要的理论意义。硒是一种人体必需的微量元素,作为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的组成成份,具有抗氧化,清除体内脂质过氧化物,阻断活性氧和自由基的损伤的作用,从而保护细胞膜及组织免受过氧化物的损伤,以维持细胞的正常功能。基于上述研究,本课题从营养角度出发,拟探讨抗氧化微量元素—硒对镉抑制猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)生长及诱导凋亡的影响,并进一步研究硒对镉激活线粒体介导的内源途径的调控作用,并对相关的凋亡蛋白bcl-2,bax进行了检测,为深入阐明硒对镉诱导凋亡的保护作用的分子机制提供重要的理论依据,为镉中毒的防治提供新的线索和思路。第一部分硒对镉抑制LLC-PK1细胞生长及其诱导细胞凋亡的影响目的:探讨硒对镉引起肾细胞生长抑制及诱导凋亡的影响。方法:本研究采用体外培养LLC-PK1的方法,通过噻唑蓝(MTT)比色法观察硒对镉抑制LLC-PK1细胞增值的影响;流式细胞技术测定硒对镉诱导细胞凋亡率的变化情况。结果:5～20μM的硒对镉抑制LLC-PK1细胞的生长具有一定的保护作用,并呈现一定的剂量效应关系;当细胞用20μM硒预先处理30 min再暴露20μM镉18 h,凋亡率为14.56%,与单独染镉组相比凋亡率明显降低(82.33%)。结论:硒对镉引起的抑制肾细胞生长及其诱导细胞凋亡均具有一定的保护作用,其机理有待进一步深入研究。第二部分硒保护镉诱导LLC-PK1细胞凋亡的机制研究目的:研究硒对镉引起线粒体途径激活的影响及凋亡相关蛋白bcl-2,bax表达的影响。方法:细胞经氧化敏感的荧光染料2,7-二氢二氯荧光素(DCFH)和罗丹明123(RH-1231)染色后,用流式细胞仪分别测定细胞内氧化水平(ROS)线粒体跨膜电位的变化;通过免疫印记法检测凋亡相关蛋白(bcl-2,bax)的表达变化;采用酶标法检测caspase-9,3酶的活性。结果:(1)20μM镉作用LLC-PK1细胞后出现ROS积聚,作用12 h达到最高峰。当加入硒和NAC(活性氧的阻滞剂)作用30min后再染镉(20μM,12 h),发现ROS水平降低。(2)同时,随着作用时间的延长,线粒体膜电位不断下降,在镉作用6 h和12 h时出现显著下降。当加入硒和NAC作用30min后再染镉(20μM,12 h),发现线粒体膜电位水平上升。硒和NAC作用30 min后再染镉12 h可以降低胞浆内细胞色素C的含量。(3)镉处理细胞12 h后,caspase-9,3活性呈明显上升,当预先加入硒或NAC作用30 min后再染镉(20μM,12 h),发现caspase-9,3活性呈明显下降趋势。(4)20μM镉作用LLC-PK1细胞12 h后,bcl-2蛋白的表达量减少,bax蛋白的表达量增加,当预先加入硒或NAC作用30 min后再染镉(20μM,12 h),发现硒可以引起bcl-2蛋白的上调和bax蛋白的下调。结论:硒对镉引起LLC-PK1细胞凋亡具有一定的保护作用,其机制可能与抑制镉引起的线粒体途径的激活,及抑制相关凋亡蛋白表达等方面有关。