论文部分内容阅读
目的：大多数品种绵羊属于季节性发情动物(如：哈萨克羊)，其生殖系统的功能主要依赖于下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus pituitary-gonadal axis，HPG轴)分泌的各种激素进行调控。下丘脑合成分泌的GnRH是调节生育的关键，而GnRH的分泌不仅受光周期调控，营养水平对绵羊发情也有一定的调控作用。本实验室前期研究发现GNAQ基因可能是参与营养调控绵羊发情的关键基因，但GNAQ基因参与营养调控绵羊发情的机制还有待研究。国外研究发现 GNAQ是光周期调控通路中kisspeptin/GPR54系统的下游基因，具有调控下丘脑GnRH 表达分泌的作用。因此，GNAQ 基因是否作为营养调控绵羊发情通路与光周期调控通路kisspeptin/GPR54系统之间的联系还有待研究。 方法：（1）下丘脑是GnRH的分泌的关键，通过原代培养绵羊下丘脑神经细胞，以此细胞为研究模型。（2）构建 GNAQ 表达载体以及干扰载体，转染至哈萨克胎羊下丘脑神经细胞中，利用qRT-PCR、Western Blot以及ELASA方法分析GNAQ对哈萨克胎羊下丘脑神经细胞GnRH的表达调控作用。（3）通过荧光定量检测GNAQ基因在绵羊各组织的表达情况。（4）对哈萨克胎羊下丘脑神经细胞施以不同水平叶酸处理，使叶酸终浓度分别为0、4、40、80mg/mL。通过BSP检测各组细胞 GNAQ 启动子区甲基化水平，利用实时荧光定量方法以及 ELASA 方法分析叶酸对绵羊下丘脑GNAQ表达水平以及GnRH分泌的影响。 结果：（1）成功培养出绵羊下丘脑神经细胞且经免疫荧光鉴定MAP2阳性细胞纯度达到95.6%。（2）在绵羊下丘脑神经细胞当GNAQ表达下调时，其上游基因KISS1、GPR54、ER均上调，下游基因PLCB1、PRKCB、GnRH也表达上调，同时GnRH的分泌水平也上调。（3）GNAQ基因在哈萨克母羊各组织中均有不同程度的表达，在垂体、下丘脑、大脑、子宫组织中具有较高的表达水平。（4）40mg/mL叶酸组DNMT1相对表达量显著高于其它各组（P＜0.05），而GNAQ相对表达量显著低于其它各组（P＜0.05），并且GNAQ的表达量随叶酸水平的增加呈先减后增的趋势。BSP检测发现40mg/mL叶酸组GNAQ启动子区有1个CpG位点发生甲基化，其它各组均未有CpG位点甲基化。另外，40mg/mL叶酸组其GnRH水平显著高于其它三组（P＜0.05），叶酸浓度过高影响GnRH的分泌。 结论：（1）GNAQ在绵羊下丘脑神经细胞中通过调控其下游PLCβ基因，通过钙离子信号通路和 PKC 信号通路直接调控 GnRH 表达分泌。GNAQ 还可以通过调控 kisspeptin 的表达，再通过kisspeptin/GPR54信号通路间接调控GnRH表达分泌。（2）DNMT1对GNAQ基因存在负调控作用，适量的叶酸水平提高DNMT1基因表达水平，促使GNAQ启动子区甲基化水平上调，进而影响GNAQ表达水平，间接调控了GnRH的分泌。（3）从GNAQ基因出发，建立了营养调控通路与光周期调控通路之间的联系。