帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种中老年人常见的神经退行性疾病,以中脑黑质多巴胺(Dopamine, DA)能神经元进行性丢失和α-突触核蛋白(a-synuclein, a-syn)沉积、路易小体(Lewy body, LB)形成为主要病理特征。当PD进展到晚期时,其运动症状及痴呆、抑郁等非运动症状可导致患者残疾,严重降低PD患者的生活质量,给照料者和社会带来了沉重的负担。目前,PD的药物治疗仅为症状性治疗,尚无充分的循证医学证据表明任何一种抗PD药物有确切的神经保护作用或延缓疾病进展作用。目前,PD确切的发病机制尚未清楚。既往,PD被认为是散发性的疾病,随着家族性PD中多个致病基因和易感基因的发现,目前认为PD是遗传因素、环境因素和老龄化共同导致的复杂疾病。近20年来,SNCA (a-synuclein)基因、LRRK2 (Leucine-rich repeat kinase 2)基因、GBA (Glucocerebrosidase)基因、parkin基因、PINK1 (PTEN induced putative kinase 1)基因及DJ-1基因等多个致病基因陆续被发现。但所有单基因突变导致的家族性PD患者占所有PD患者的比例小于5%,这提示,对于占大多数的散发性PD,有其他的遗传因素影响了疾病的发生和发展。近年来,一些大型的全基因组关联研究(Genome Wide Association Study, GWAS)发现了多个基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点与散发性PD易感性存在关联。SNCA基因、GBA基因、MAPT (Microtubule associated protein tau)基因、LRRK2基因及RIT2 (Ras-like without CAAX 2)基因等的SNP位点已被多项GWAS研究证实与散发性PD的易感性相关。这些易感基因特定位点的遗传多态性与PD发病并非确切的因果关系,但可通过影响相应蛋白的编码或转录后修饰等影响蛋白的生物学功能,从而影响散发性PD的易感性,因此,寻找PD的易感基因对于阐明遗传因素在散发性PD中的作用具有重要意义。一般认为,在遗传因素、环境因素和老龄化的共同作用下,神经炎症、氧化应激及线粒体功能障碍、溶酶体功能障碍、α-syn朊蛋白样的传播等多方面的机制参与了DA能神经元的损伤与死亡,促进了PD的发生发展。其中小胶质细胞过度活化介导的神经炎症在导致DA能神经元最终死亡的级联反应中起到了重要作用。小胶质细胞是中枢神经系统(central nerve system, CNS)常驻巨噬细胞,它在神经炎症中具有双面作用：一方面可监控CNS内环境,吞噬、清除变性死亡的神经元,避免组织损伤所导致的神经炎症,这是机体保护性机制之一；另一方面,它被过度活化后,则可持续分泌白介素-1β (Interleukin-1β, IL-1p)、白介素-6 (Interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)等炎症因子,导致神经炎症持续存在。在PD患者及MPTP小鼠的病理研究中,均发现黑质出现大量激活的小胶质细胞,且小胶质细胞的激活先于DA能神经元的死亡,说明神经炎症并不只是神经元变性死亡的伴随结果,而是参与了促进DA能神经元死亡的过程。小胶质细胞介导的神经炎症可直接诱导神经元凋亡,或间接引起氧化应激,共同促进了DA能神经元最终的死亡,加速了PD的进展。因此,及时阻断神经炎症,有望成为PD神经保护治疗的潜在靶点。髓样细胞表达的触发受体-2 (Triggering receptor expressed on myeloid cells-2, TREM2)是表达在小胶质细胞、巨噬细胞、树突状细胞及破骨细胞等髓样细胞膜表面的免疫受体。研究表明,刺激小胶质细胞表面的TREM2受体一方面可促进小胶质细胞的吞噬活动,另一方面可抑制小胶质细胞产生和释放促进炎症的细胞因子,如TNF-α、IL-1β及IL-6等。换言之,TREM2可促进小胶质细胞清除CNS中受损或凋亡的细胞及细胞碎片,预防和缓解组织损伤所致的神经炎症,从而起到抗炎作用。最近,TREM2在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)和PD等多种神经退行性疾病中的作用颇受关注。2013年,两项独立的GWAS研究先后证实了位于TREM2基因外显子2上的rs75932628 (p.R47H)位点的错义突变C/T可使美国及欧洲人群患AD的风险增加近3倍。2013年,Rayaprolu等病例对照研究显示,TREM2基因rs75932628位点C/T杂合突变是美国人群散发性PD的易感因素(OR值为2.67)。2014年,西班牙和美国人群中的研究亦验证了rs75932628位点C/T杂合突变与散发性PD发病风险相关。另外,多项研究显示,rs75932628位点C/T杂合突变是额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化的遗传易感因素,提示TREM2基因多态性与多种神经退行性疾病相关,可能在神经退行性疾病病理生理过程中起到了重要作用。在正常人脑组织中,TREM2基因的mRNA表达水平在脑白质、中脑黑质、壳核的小胶质细胞中较高,在小脑中表达相对较低。而病理研究发现,在5例有TREM2突变的正常人脑组织中,其中有2例脑组织存在LB病理样改变,提示TREM2突变可能与PD的病理改变存在关系。另外,尽管TREM2配体具体是何种物质目前尚不清楚,细胞实验发现,DA能神经元可表达与TREM2结合的配体,使得死亡的DA能神经元被小胶质细胞识别并吞噬。综合以上研究结果,我们有充分的理由推测TREM2可能在PD的发生发展中起到重要的作用。TREM2作为介导吞噬的免疫受体,可以促进小胶质细胞清除CNS中受损或凋亡的细胞及细胞碎片,抑制神经炎症；那么,在PD中,TREM2能否通过促进小胶质细胞对变性死亡的DA能神经元和胞外α-syn的吞噬,同时下调神经炎症,从而减少细胞外α-syn的堆积呢?目前未见相关研究报道。另外,基因多态性受地域差异和种族差异影响较大,但中国汉族人群中TREM2基因多态性与PD易感性的关联研究尚未见报道。因此,本研究拟对TREM2基因第2外显子进行直接测序,并分析TREM2基因多态性与中国汉族人群PD发病风险的关联性。并进一步在MPTP慢性PD模型小鼠中研究TREM2、α-syn,及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达水平,以初步探讨TREM2在小胶质细胞介导的PD神经炎症中的作用。本研究包括两部分：1.TREM2基因多态性与帕金森病的相关性研究；2.MPTP诱导的PD慢性模型小鼠中TREM2基因的表达水平研究。第一章TREM2基因多态性与帕金森病的相关性研究目的：探讨TREM2基因多态性与帕金森病患者发病风险是否相关。方法：以476例PD患者及432例正常对照者作为研究对象。(1)收集所有受试者的一般资料和血液标本。(2)提取所有受试者血液标本的DNA,对TREM2第2外显子进行直接测序。(3)比较PD患者及正常对照的TREM2第2外显子中rs75932628、rs142232675、rs201258663、rs143332484、p.Y38C及rs104894002位点的等位基因和基因型总体分布差异。率的比较用χ2检验,P<0.05差异有统计学意义。结果：①PD组和正常对照组在年龄和性别分布上无统计学差异(P>0.05)。②在908例进行测序的受试者中,仅在1例PD患者中检测到rs75932628位点存在C/T杂合突变,其最小等位基因频率(MAF)为0.06%。Rs142232675、 rs201258663、rs143332484、p.Y38C、rs104894002及其他位点未检测到杂合突变或纯合突变。③PD患者和正常对照的rs75932628、rs201258663、rs143332484、p.Y38C及rs104894002等其他位点的基因型及等位基因分布无统计学差异(P>0.05)。结论：(1)中国南方汉族人群TREM2基因外显子2区域突变频率低于起源于欧洲的人群。(2)Rs75932628位点等位基因“T”不是中国南方汉族人群PD发病风险的易感等位基因。第二章MPTP诱导的PD慢性模型小鼠中TREM2基因的表达水平研究目的：比较MPTP腹腔注射诱导的PD模型小鼠与对照小鼠中TREM2及其下游炎症因子的表达水平是否存在差异,以初步探讨TREM2在PD神经炎症中的作用。方法：以C57BL/6J小鼠为研究对象,分为MPTP+丙磺舒模型组,丙磺舒对照组和生理盐水对照组三组。通过小剂量MPTP长期腹腔注射诱导PD慢性模型。取脑组织后进行以下实验：(1)进行石蜡切片,用免疫组织化学染色方法检测小鼠中脑黑质TH染色阳性细胞。(2)提取脑组织总RNA,用荧光定量PCR方法检测TREM2、α-syn、IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS基因的mRNA表达水平。采用单因素方差分析比较三组间多巴胺能神经元死亡情况、TREM2基因、α-syn基因及炎症因子的mRNA表达水平,P<0.05为差异有统计学意义。结果：①MPTP模型组中TH染色阳性细胞数低于丙磺舒对照组及生理盐水对照组,差异有统计学意义(P<0.05),MPTP模型组中TH染色阳性细胞数目较生理盐水对照组减少了42.8%。②MPTP模型组、生理盐水对照组及丙磺舒对照组三组间TREM2.IL-1β、 IL-6、TNF-α及iNOS基因mRNA相对表达水平有显著性差异(P<0.05),MPTP组显著高于生理盐水组及丙磺舒组(P<0.05)。MPTP组SNCA基因mRNA相对表达水平高于生理盐水组及丙磺舒组,但三组间比较未达到统计学差异(P>0.05)。结论：(1) MPTP联合丙磺舒腹腔注射建立的PD慢性小鼠模型中,中脑黑质致密部DA能神经元显著减少,PD模型中存在明显的神经炎症。(2) MPTP小鼠PD慢性模型中脑TREM2基因mRNA表达增高,提示TREM2在PD发病过程中起到一定作用,TREM2对PD发病是否具有保护保护作用有待进一步研究证实。