目的:泥蚶(Arca granosa Linne)是我国山东半岛及南部沿海地区一类重要经济贝类,其外壳为传统中药“瓦楞子”主要来源之一。现代研究表明,蚶肉富含碳水化合物、蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质及微量元素等营养物质,具有极高的食疗保健价值。因此,合理、科学地开发泥蚶资源具有重要现实意义。并且前期调研发现,泥蚶多糖(polysaccharide from Arca granosa,AGP)可用作免疫佐剂,提高机体免疫应答水平。然而,目前关于泥蚶多糖的免疫调节作用研究尚不系统、深入。因此,本课题结合现有文献,应用现代技术手段,以泥蚶脱脂肉体部分为原料,开发建立AGP提取、分离、纯化工艺流程并初步研究其理化性质;体外以RAW 264.7细胞为研究模型,综合评价泥蚶多糖体外免疫调节活性并初步阐明其分了作用机制。旨在为泥蚶多糖的功能保健品或药品开发奠定前期理论基础。方法:1 采用响应面法分别优化超声轴助提取(Ultrasonic assisted extraction,UAE)法提取泥蚶多糖及凹土吸附法(palygorskite adsorption treatment,PAT)脱蛋白工艺:通过拟合动力学及吸附等温线方程、分析热力学参数研究PAT法吸附学行为;采用连续吸附-解吸附实验并与传统方法Sevage法比较分别验证PAT法可重复利用性和可靠性:联合使用DEAE柱层析及葡聚糖柱层析建立AGP分级纯化工艺。2 采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、氯化钡-明胶比色法及硫酸-咔唑法分别测定泥蚶多糖纯化组分(purified polysaccharide from Arca granosa,AGPP)中总糖、蛋白质、硫酸基及糖醛酸含量;采用酸水解-衍生化-气相色谱分析法分析单糖组成;凝胶排阻色谱法测定AGPP分子量。3 通过MTT法、中性红法考察AGPP对RAW264.7细胞增殖吞噬 能力的影响;采用Griess法、ELISA法分别测定AGPP处现后 NO、TNF-α、IL-6的分泌水平;此外,通过PMB 与 AGPP共处理排除AGPP样品中内毒素污染。4 通过采用不同模式识别受体抑制剂与AGPP共处理RAW 264.7细胞,测定NO、TNF-α、IL-6分泌量,初步判断AGPP的识别受体:采用Western blot检测TLR4通路相关蛋白IRAK-1、IRF3、p-IRF3、IKK、p-IKK、p65、p-p65 的表达量;通过 rt-qPCR测定TLR4下游因子(IL-6、TNF-α、IP-10、IFN-β)mRNA的表达水平。结果:1 超声辅助提取最佳条件为:料液比1:33 g/mL,提取温度61℃,提取时间80 min,超声功率640 W,得最大得率为8.74%;凹上吸附处理脱蛋白最佳吸附条件为(AGP溶液浓度为2mg/mL):吸附温度60℃,吸附时间136 min,凹土用量0.27 g,得最大KC值为12.28;吸附过程动力学和吸附等温线分别可以用准二级动力学方程及Freundlich方程拟合;此外,山热力学参数ΔG及AH分析得,PAT法吸附过程是自发、吸热的反应,其吸附过程兼具物理吸附及化学吸附;经5次吸附-解吸附后Dr%为75.19%。2 AGPP中总糖、蛋白、糖醛酸、硫酸基含量分别为90.97%±1.1%、0.23%±0.13%、2.76%±0.16%、7.94%±0.24%;此外,AGPP仅由葡萄糖组成且分子量为109.65 KDa。3 AGPP能够激活RAW264.7,并能促进其细胞增殖率并能提高吞噬能力;此外,经AGPP处理后,NO、TNF-α及IL-6分泌量均显著性提高,且呈现一定的剂量依赖性;AGPP与PMB共处理RAW264.7细胞,其NO分泌量变化无统计学意义。4经AGPP与anti-TLR4共处理后,其NO、TNF-α、IL-6分泌量显著性下降;Western bolt检测发现AGPP促进其IRAK-1的泛素化降解,提高TLR4通路相关蛋白IRF3、IKK、p65的磷酸化表达水平,呈现一定的剂量相关性;此外,TLR4抑制剂C34可抑制其IRAK-1的泛素化降解,抑制TLR4通路相关蛋白IRF3、IKK、p65的磷酸化表达;并且,q-rtPCR检测发现AGPP能够提高下游炎症因子(TNF-α、IL-6、IFN-β、IP-10)的mRNA表达水平,同时C34可抑制AGPP的促进作用。结论:1 UAE法能够高效、快速的提取泥蚶多糖;此外,本实验开发的PAT法脱蛋白高效、环保,其吸附过程稳定、可靠,为一种理想的脱蛋白方法,可广泛用于其他种类多糖的脱蛋白研究。2 AGPP无内毒素污染,能够促进RAW264.7细胞增殖并增强其吞噬能力,提高NO、IL-6、TNF-α的分泌水平,证明AGPP具有免疫增强作用。3 AGPP可激活TLR4介导的MyD88和TRIF信号通路进而发挥免疫增强作用。