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目的:研究黄芪苷Ⅳ(astragalosideⅣ,AST)抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的作用,探讨该作用是否通过ERK1/2信号转导通路实现。
方法:
1.H2O2诱导H9c2细胞损伤模型的建立用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养H9c2细胞24h,换用无FBS的高糖DMEM培养基,用100,200,400μmol/L的H2O2处理细胞3,6,12h,采用MTT法检测细胞存活率。选择适宜的H2O2浓度和作用时间,建立H2O2诱导H9c2细胞损伤模型。
2.AST抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤作用的研究用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养H9c2细胞24h,按以下分组分别加入不同药物孵育6h。实验分4组:①正常对照组(Control组):加入无FBS的高糖DMEM培养基；②模型组(H2O2组):加入200μmol/L的H2O2；③AST10+H2O2组:同时加入10mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；④AST20+H2O2组:同时加入20mg/L的AST和200μmol/L的H2O2。用MTT法测定细胞存活率、比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)活性、总超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutase,T-SOD)和Mn超氧化物歧化酶(manganesesuperoxidedismutase,Mn-SOD)活力以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。
3.AST通过ERK1/2信号通路抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤作用的研究用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养H9c2细胞24h,按以下分组分别加入不同药物孵育6h。实验分7组:①至④分组同上。⑤PD+H202组:加入50μmol/L的PD98059作用30min,再加入200μmol/L的HEO2；⑥PD+AST10+H2O2组:加入50μmol/L的PD98059作用30min,再同时加入10mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；⑦PD+AsT20+H2O2组:加入50μmol/L的PD98059作用30min,再同时加入20mg/L的AST和200μmol/L的H2O2。用MTT法测定细胞存活率、比色法测定细胞培养液中LDH活性、T-SOD和Mn-SOD活力以及MDA含量；Westernblot检测H9c2细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
结果:
1.H2O2诱导H9c2细胞损伤模型的建立H2O2处理3h,与Control组比较,100,200,400μmol/L的H2O2使细胞存活率随浓度增加而显著降低(94.6％±4.59％,84.7％±15.2％,66.3％±14.9％vs.100％±0,P<0.05)；H2O2处理6h,与Control组比较,100,200,400μmol/L的H2O2使细胞存活率随浓度增加而显著降低(92.5％±7.15％,63.9％±10.1％,30.8％±9.83％vs.100％±0,P<0.01)；H2O2处理12h,与Control组比较,100,200,400μmol/L的H2O2使细胞存活率随浓度增加而显著降低(69.4％±10.9％,24.7％±3.06％,24.7％±2.61％vs.100％±0,P<0.01)。其中,在H2O2浓度为200μmol/L作用6h条件下,细胞存活率降低程度适中,实验结果重复性好,确定后续实验采用200μmol/LH2O2作用6h建立模型。
2.AST抗H2O2诱导的H9e2细胞氧化损伤与Control组比较,200μmol/LH2O2作用6h使细胞存活率显著降低(70.3％±6.52％vs.100％±0,P<0.01)；细胞培养液中LDH活性显著升高(289.4±15.8vs.26.7±6.6U/L,P<0.01)；T-SOD,Mn-SOD活力显著降低(8.80±1.42vs.19.68±1.70,3.21±0.65vs.6.58±1.45U/ml,P<0.01)；MDA含量显著升高(0.955±0.120vs.0.307±0.056μmol/L,P<0.01)。
与H2O2组比较,10mg/L及20mg/LAST均显著提高细胞存活率(89.4％=7.57％,90.1％±4.04％vs.70.3％±6.52％,P<0.01)；使细胞培养液中LDH活性显著降低(147.2±34.3,170.4±14.0vs.289.4±15.8U/L,P<0.01)；T-SOD(14.99±0.98,13.76±2.06vs.8.80±1.42U/ml,P<0.01)及Mn-SOD活力(6.434±0.69,6.15±0.97vs.3.21±0.65U/ml,P<0.01)显著提高；MDA含量显著降低(0.506±0.051,0.542±0.035Vs.0.955±0.120μmol/L,P<0.01)。
3.AST通过ERK1/2信号通路抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤分别与10mg/L及20mg/LAST组比较,加入ERK1/2抑制剂PD98059后细胞存活率显著降低(73.5％±5.96％vs.89.4％±7.57％,74.7％±74.7％vs.90.1％±4.04％,P<0.01)；细胞培养液中LDH活性显著提高(277.1±27.3vs.147.2±34.3,275.7±28.7vs.170.4±14.0U/L,P<0.01)；T-SOD(10.52±1.56vs.14.99±0.98,9.99±1.54vs.13.76±2.06U/ml,P<0.01)及Mn-SOD活力(3.93±0.97vs.6.43±0.69,3.66±0.81vs.6.15±0.97U/ml,P<0.01)显著降低；MDA含量显著提高(0.844±0.054vs.0.506±0.051,0.855±0.043vs.0.542±0.035μmol/L,P<0.01)。
10mg/L及20mg/LAST均显著增加H2O2损伤的H9c2细胞P-ERK1/2蛋白的表达(P<0.01),用PD98059预处理则p-ERK1/2的表达明显被抑制(P<0.01)。
结论:
1.200μmol/LH2O2作用6h制备H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤模型,细胞存活率降低程度适中,重复性好,模型建立成功。
2.10mg/L及20mg/L的AST使H2O2损伤的H9c2细胞存活率提高,细胞培养液中LDH活性降低、T-SOD及Mn-SOD活力升高、MDA含量减少,说明高、低剂量的AST均能抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤。
3.AST上调H2O2损伤的H9c2细胞ERK1/2的磷酸化水平,且AST的保护作用可被ERK1/2抑制剂PD98059阻断,说明AST通过ERK1/2信号通路抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤。
方法:
1.H2O2诱导H9c2细胞损伤模型的建立用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养H9c2细胞24h,换用无FBS的高糖DMEM培养基,用100,200,400μmol/L的H2O2处理细胞3,6,12h,采用MTT法检测细胞存活率。选择适宜的H2O2浓度和作用时间,建立H2O2诱导H9c2细胞损伤模型。
2.AST抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤作用的研究用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养H9c2细胞24h,按以下分组分别加入不同药物孵育6h。实验分4组:①正常对照组(Control组):加入无FBS的高糖DMEM培养基；②模型组(H2O2组):加入200μmol/L的H2O2；③AST10+H2O2组:同时加入10mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；④AST20+H2O2组:同时加入20mg/L的AST和200μmol/L的H2O2。用MTT法测定细胞存活率、比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)活性、总超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutase,T-SOD)和Mn超氧化物歧化酶(manganesesuperoxidedismutase,Mn-SOD)活力以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。
3.AST通过ERK1/2信号通路抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤作用的研究用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养H9c2细胞24h,按以下分组分别加入不同药物孵育6h。实验分7组:①至④分组同上。⑤PD+H202组:加入50μmol/L的PD98059作用30min,再加入200μmol/L的HEO2；⑥PD+AST10+H2O2组:加入50μmol/L的PD98059作用30min,再同时加入10mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；⑦PD+AsT20+H2O2组:加入50μmol/L的PD98059作用30min,再同时加入20mg/L的AST和200μmol/L的H2O2。用MTT法测定细胞存活率、比色法测定细胞培养液中LDH活性、T-SOD和Mn-SOD活力以及MDA含量；Westernblot检测H9c2细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
结果:
1.H2O2诱导H9c2细胞损伤模型的建立H2O2处理3h,与Control组比较,100,200,400μmol/L的H2O2使细胞存活率随浓度增加而显著降低(94.6％±4.59％,84.7％±15.2％,66.3％±14.9％vs.100％±0,P<0.05)；H2O2处理6h,与Control组比较,100,200,400μmol/L的H2O2使细胞存活率随浓度增加而显著降低(92.5％±7.15％,63.9％±10.1％,30.8％±9.83％vs.100％±0,P<0.01)；H2O2处理12h,与Control组比较,100,200,400μmol/L的H2O2使细胞存活率随浓度增加而显著降低(69.4％±10.9％,24.7％±3.06％,24.7％±2.61％vs.100％±0,P<0.01)。其中,在H2O2浓度为200μmol/L作用6h条件下,细胞存活率降低程度适中,实验结果重复性好,确定后续实验采用200μmol/LH2O2作用6h建立模型。
2.AST抗H2O2诱导的H9e2细胞氧化损伤与Control组比较,200μmol/LH2O2作用6h使细胞存活率显著降低(70.3％±6.52％vs.100％±0,P<0.01)；细胞培养液中LDH活性显著升高(289.4±15.8vs.26.7±6.6U/L,P<0.01)；T-SOD,Mn-SOD活力显著降低(8.80±1.42vs.19.68±1.70,3.21±0.65vs.6.58±1.45U/ml,P<0.01)；MDA含量显著升高(0.955±0.120vs.0.307±0.056μmol/L,P<0.01)。
与H2O2组比较,10mg/L及20mg/LAST均显著提高细胞存活率(89.4％=7.57％,90.1％±4.04％vs.70.3％±6.52％,P<0.01)；使细胞培养液中LDH活性显著降低(147.2±34.3,170.4±14.0vs.289.4±15.8U/L,P<0.01)；T-SOD(14.99±0.98,13.76±2.06vs.8.80±1.42U/ml,P<0.01)及Mn-SOD活力(6.434±0.69,6.15±0.97vs.3.21±0.65U/ml,P<0.01)显著提高；MDA含量显著降低(0.506±0.051,0.542±0.035Vs.0.955±0.120μmol/L,P<0.01)。
3.AST通过ERK1/2信号通路抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤分别与10mg/L及20mg/LAST组比较,加入ERK1/2抑制剂PD98059后细胞存活率显著降低(73.5％±5.96％vs.89.4％±7.57％,74.7％±74.7％vs.90.1％±4.04％,P<0.01)；细胞培养液中LDH活性显著提高(277.1±27.3vs.147.2±34.3,275.7±28.7vs.170.4±14.0U/L,P<0.01)；T-SOD(10.52±1.56vs.14.99±0.98,9.99±1.54vs.13.76±2.06U/ml,P<0.01)及Mn-SOD活力(3.93±0.97vs.6.43±0.69,3.66±0.81vs.6.15±0.97U/ml,P<0.01)显著降低；MDA含量显著提高(0.844±0.054vs.0.506±0.051,0.855±0.043vs.0.542±0.035μmol/L,P<0.01)。
10mg/L及20mg/LAST均显著增加H2O2损伤的H9c2细胞P-ERK1/2蛋白的表达(P<0.01),用PD98059预处理则p-ERK1/2的表达明显被抑制(P<0.01)。
结论:
1.200μmol/LH2O2作用6h制备H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤模型,细胞存活率降低程度适中,重复性好,模型建立成功。
2.10mg/L及20mg/L的AST使H2O2损伤的H9c2细胞存活率提高,细胞培养液中LDH活性降低、T-SOD及Mn-SOD活力升高、MDA含量减少,说明高、低剂量的AST均能抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤。
3.AST上调H2O2损伤的H9c2细胞ERK1/2的磷酸化水平,且AST的保护作用可被ERK1/2抑制剂PD98059阻断,说明AST通过ERK1/2信号通路抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤。