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邻苯二甲酸二辛酯(Di-n-octyl ortho-phthalate,DOP)是邻苯二甲酸的酯化衍生物,属于邻苯二甲酸酯类(PAEs,又名酞酸酯)。应用于涂料、食品包装材料、润滑剂、药品、化肥、化妆品、农药、医疗器械、儿童玩具等领域,是一种广泛利用的增塑剂。DOP具有生物富集作用,对人体造成神经毒性、生殖毒性和多器官癌变等病变,严重威胁到人的生存与发展,已经引起国内外广泛关注。美国环保局(EPA)已经将其列入优先控制有毒污染物,DEP、DMP与DOP也被中国政府确定为优先控制污染物。毒理学实验表明DOP对人体具有致突变性、致癌性、致畸形和拟／抗甲状腺激素活性、拟／抗雌激素活性等内分泌干扰特性；同时是一种环境激素类化合物。环境中的DOP主要通过生物降解和光解这两种途径,光解速度较慢、周期较长,因此生物降解是DOP降解的最主要方式。目前对DOP微生物降解的研究包括降解菌的筛选、鉴定、降解途径及降解特性分析,对降解途径中蛋白的主要功能的研究较少。本文以戈登氏菌属Gordonia sp. HS-NH1为材料,克隆表达了邻苯二甲酸酯降解过程中的关键酶邻苯二甲酸酯酶(PehA)和邻苯二甲酸单酯酶(PehB),并研究了其功能和特性。结合基因敲降技术构建了缺失转运蛋白ABC/MFS基因的敲除突变株,并对突变株的代谢途径与降解特性进行了研究。主要结果如下：通过基因组扫描得知戈登氏菌HS-NH1的pehA基因全长594bp,编码197个氨基酸,经过blast比对发现其与红球菌属Rhodococcus sp. YK2的pehA序列(GI：21388688)同源性较高,达到98%；pehB基因全长852bp,编码283个氨基酸,与戈登氏菌属Gordonia sp. P8219的pehB序列(GI：85677422)具有99%的相似性。采用基因克隆技术,通过设计引物、PCR扩增,成功构建了重组表达质粒pET-pehA和pET-pehB,并在E.coliBL21得到高效表达。SDS-PAGE电泳分析,重组酶PehA和PehB的分子量分别为27KDa和30Kda。酶活性检测表明重组酶PehA和PehB对长链的PAE具有良好的水解活性。为进一步深入研究该酶的功能与结构奠定了一定的基础。利用同源重组的方法敲除了戈登氏菌(Gordonia sp.)HS-NH1的ABC和MFS转运蛋白基因,成功构建了ABC转运蛋白敲除突变菌株和MFS转运蛋白敲除突变菌株,分别命名为HS-NH1-△MFS和HS-NH1-△ABC。对突变菌株的代谢途径、基因功能与降解特性进行了研究。研究结果表明：戈登氏菌(Gordonia sp.)HS-NH1降解DOP的最适生长条件为30℃、pH 7.0,该菌能在120小时内DOP降解率为80%。突变株HS-NH1-△MFS在同等条件下(温度为30℃、pH 7.0)对DOP的降解效率显著下降,降解效率仅有20%；而突变菌株HS-NH1-△ABC不能以DOP为唯一碳源的培养机中生长。底物广谱性分析表明,戈登氏菌(Gordonia sp.HS-NH1)能高效利用常见的PAE(如DOP.DEHP),及其代谢物(PCA)。突变菌株HS-NH1-△MFS能够利用长链的邻苯二甲酸酯类,如DOP、DEHP等,但利用效率较低；不能利用短链的PAE,如邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)以及邻苯二甲酸(PA)与原儿茶酸PCA等；而HS-NH1-△ABC不能在PAE及其代谢产物作作为唯一碳源的培养基中生长。说明MFS与ABC转运蛋白都能转运邻苯二甲酸,将邻苯二甲酸运输到细胞内进行进一步降解,ABC转运蛋白作为PA主要的运输蛋白,MFS转运蛋白作为辅助的运输蛋白。