论文一犬穿通性颅脑火器伤模型的建立及其生理、病理改变的观察目的对现有犬穿通性颅脑火器伤模型进行改进,延长动物的存活时间,观察其生理、病理改变,为颅脑火器伤的病理、生理和分子生物学研究提供更加完善的平台。方法本地成年雄性杂种犬19只,体重20～25kg,随机分为三组:A组按照传统模型,直接致伤,n=5;B组为改进的模型,左侧额颞顶部骨瓣开颅,骨窗大小约6.0×8.0cm,暴露脑组织后致伤,n=9:C组为对照组,n=5,仅予开颅手术。致伤枪支为东风-SS03型小口径速射手枪,初速190～210米/秒,弹丸质量2.60±0.05g。实验前30min给予吗啡10mg、阿托品0.5mg肌肉注射,实验开始时给予硫贲妥钠25mg/kg腹腔注射,气管插管,以中间带孔的木制牙垫固定于张口位,枪击前静脉给予氯胺酮40～50mg。犬仰卧,头偏向右侧、固定,头下垫沙袋及厚木板,手枪固定于金属支架上,距离犬头20cm,激光指示器校准;入射点:A组为左侧额骨颧突后2.5～3.0cm,B组为左侧额叶冠状回中部,入射角度90°;射击后受伤脑组织不做电凝止血,仅以明胶海绵、棉片保护创伤区。惠普78354C型生理监测仪连续记录心率、血压、呼吸变化,致伤后30min动脉采血做血气分析,静脉采血检验血糖及肝、肾功能。B组伤后6h,从四个区域取皮层脑组织,分别距伤道＜0.5cm、0.5～2.0cm、2.0～4.0 cm、＞4.0cm,C组同一时间按照对应部位取标本。一部分以甲醛固定,常规石蜡包埋、切片、HE染色,光镜下观察;另一部分以戊二醛保存,锇酸固定,Epon812包埋,超薄切片,电镜观察。统计学处理采用t检验及方差分析。结果B组伤后呼吸暂停时间和存活时间均大于A组(P＜0.01);A组MAP于伤后10min降至最低点,继之以小幅度的升高,后期逐渐降低至正常值水平以下;B组伤后出现快速而短暂的明显的血压升高,继而于伤后10min大幅度降低至波谷,后期逐渐回升至接近正常值水平;伤后两组心率均立即下降,伤后10min回升达峰值,之后再次缓慢下降,B组的变化幅度大于A组。伤后30min,A、B两组致伤犬除血糖高于C组(p＜0.05)之外,其他指标差异不显著。光镜下,脑组织可出现空泡化、网格化,神经元胞体、胞核固缩、变形,胞质深染,可见核偏移;星形胶质细胞增大明显,小胶质细胞增多;脑组织间散在小片状出血,蛛网膜下腔出血,血管周围间隙明显增宽,部分血管破裂出血。电镜下,神经元胞核内异染色质凝聚、边集,核膜模糊,胞质部分溶解,胞膜破损,粗面内质网扩张、脱颗粒,线粒体嵴破坏、消失、甚至空泡化,核糖体减少,溶酶体增多;胶质细胞足突肿胀,胞膜破损,线粒体肿胀,嵴消失,呈空泡状;有髓神经纤维脱髓鞘多见,可见局部缺损、断裂,轴索区形成空腔;血脑屏障内皮细胞胞膜模糊、局部破损,胞核内异染色质边集,线粒体嵴缺失、空泡化,胞质内有较多的胞饮小泡,基膜大部分模糊,局部溶解。距离原发伤道越近,组织损害程度越重。结论经过改进的犬穿通性颅脑火器伤模型与现有的模型相比,动物伤后存活时间明显延长,弹着点更准确,伤道一致性更好,有利于进行更为深入的病理、生理和分子生物学研究。论文二犬穿通性颅脑火器伤脑组织继发损害机制的研究目的探讨TNF-α和NF-κB/Rel家族成员在犬穿通性颅脑火器伤脑组织继发损害机制中的作用,并比较它们在脑组织不同区域的表达差异,为更精确地划分受损伤脑组织的病理分区提供依据。方法本地成年雄性杂种犬14只,体重20～25kg,随机分为两组:B组(n=9)为改进的模型,暴露脑组织后致伤;C组为对照组(n=5),仅予开颅手术。B组于致伤后6h分别从三个区域取皮层脑组织,分别距伤道0.5～2.0cm、2.0～4.0 cm、＞4.0cm,标志为B1组、B2组、B3组;C组于开颅手术后6h从皮层对应部位取材;一部分标本以10%甲醛溶液固定,24h后常规石蜡包埋、切片,采用免疫组化SABC法检测,一抗为兔抗大鼠TNF-α、兔抗山羊COX-2、Caspase-3,每张切片选取5个高倍视野,每高倍视野计数100个细胞,计算阳性细胞百分比。另一部分标本液氮保存,分别行western blot及RT-PCR检测。western blot采用兔抗大鼠TNF-α、兔抗山羊COX-2、兔抗山羊Caspase-3一抗,以β-actin为内参照,Bandleader软件分析各电泳条带与β-actin蛋白含量的比值,计算相对量。RT-PCR以gapdh为内参照,TNF-α(413bp)上游引物:5’CCC CAA GTG ACA AGC CAG TA 3’,下游引物:5’CAA AGT CCA GAT TAG GCA GAT 3’;NF-κB(P65)(490bp)上游引物:5’TAA TCG CCA TAG CCA TAG TCG 3’,下游引物:5’GTT TTG CCT CCC AGT TCTGA 3’;NF-κB(P52)(381bp)上游引物:5’CCT ATC CAC GAC AAC CTT GC 3’,下游引物:5’CAT AGA TGC TGC TGA CCC AAC 3’;COX-2(238bp)上游引物:5’ATCCCC TTC CTG CGA AAT AC 3’,下游引物:5’GCA GAA GAA ACT TTT CCA CAA TC 3’:Caspase-3(416bp)上游引物:5’ACC CGA AGG CTT GCA TAA GG 3’,下游引物:5’ACC GAG GTG CCA TTC CAG TA 3’;gapdh(419bp);上游引物:5’TCC CGC CAACAT CAAA 3’,下游引物:5’TGACCTTGC CCA CAG C 3’。PCR反应产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统下观察并摄像,用Bandleader软件进行扫描分析,以目的基因条带与gapdh条带吸光度容积的比值作为目的基因mRNA的相对含量。以上数据应用SPSS10.0软件,多组之间比较采用方差分析。结果TNF-α和COX-2的阳性染色部位为胞浆,致伤后在不同区域的脑组织的表达率由B3至B2、B1逐步升高,差异显著,它们与正常脑组织之间也存在显著差异;Caspase-3在胞核、胞浆均有阳性染色,B2、B3以及C组之间的阳性表达率具有显著差异。Western blot显示:TNF-α、COX-2、Caspase-3蛋白在不同区域的脑组织的表达相对量均高于正常脑组织,其差异具有显著性(p＜0.05);其中B1与B2组COX-2蛋白的表达相对量具有显著差异(p＜0.01)。RT-PCR显示:TNF-α、P65、P52、COX-2、Caspase-3的mRNA在不同区域的脑组织的表达相对量与正常脑组织之间均有显著差异(p＜0.01);其中P65、COX-2的表达相对量由B3至B2、B1组逐步增高,具有统计学意义。结论(1)TNF-α参与了犬脑火器伤后的继发性损害,但与损害的程度之间并不是简单的线性关系;(2)RNA水平的检测提示RelA(p65)和NF-κB(p52)都参与了犬脑火器伤后的继发性损害,但在因外源性刺激而激活的NF-κB蛋白中RelA(p65)可能比NF-κB(p52)具有更大的比重,主要是由RelA(p65)介导了颅脑火器伤的继发性脑损害。(3)通过免疫组化、western blot和RT-PCR的方法,观察到COX-2和Caspase-3的水平在火器伤犬脑组织中的表达均显著高于单纯手术犬,提示它们都参与了犬脑火器伤后的继发性损害,神经细胞的变性和调亡是同时存在的。在不同创伤分区之间表达的差异显示,因火器伤所致的神经细胞减少,可能更多地归因于COX-2介导的神经元变性;而Caspase-3在不同创伤分区之间的表达差异并不肯定,提示至少在脑火器伤的早期,神经细胞的调亡并不是主要事件。论文三实验性犬颅脑火器伤的皮层脑电监测目的通过对动物模型犬的颅脑火器伤后皮层脑电监测(ECoG),初步探讨颅脑火器伤与脑电特征的相关性。方法本地成年雄性杂种犬9只,体重20～25kg,左侧额颞顶部骨瓣开颅,骨窗大小约6.0×8.0cm,暴露脑组织;应用Oxford Medelec数字脑电图系统行ECoG监测,采用银针电极固定于额极、中央区、顶、枕区,另设头皮参考电极2个,以参考导联方式记录,灵敏度50uV/5mm,高频滤波30Hz,时间常数0.3S,走纸速度30mm/s,行ECoG监测＞30min后,以东风-SS03型小口径速射手枪射击冠状回中部致伤并观察生理、生化指标,伤后30min再行ECoG监测,持续监测时间＞30min,分析损伤早期不同区域的ECoG变化情况。结果通过连续观察实验犬火器伤后的ECoG,损伤早期基本节律普遍抑制,以脑组织直接破坏区最显著,波幅低平提示严重损害;脑破坏区周围的波幅波率有所增加,间断给氧可见波幅和频率变化,此反应性有良好预后趋向。结论ECoG监测在颅脑火器伤后的动态观察有利于早期诊断,对损伤程度的评估和判定预后也有一定价值。