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研究背景:大肠癌(colorectal carcinoma)是严重威胁人类生存的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率在西方国家居恶性肿瘤的第2位,在我国居第4位。经临床研究发现,大肠癌的5年存活率较低。因此,早期发现、诊断与治疗是提高大肠癌患者生存率的关键。但由于传统治疗方法的特异性、敏感性差,致使治疗效果欠佳。近年来,随着分子生物学技术的快速发展,大肠癌发生发展的分子机制也取得了突破性研究。而临床研究表明,细胞的增殖是导致肿瘤发展的重要原因,因此研究大肠癌增殖和凋亡的分子机制显得尤为重要。Pin1,肽基脯氨酰异构酶(peptidy-prolyl cis/trans isomerase PPIase)是多肽脯氨酰基顺反异构酶(PPIase)家族成员之一,是一种高度保守、特异的顺反异构酶,可特异性地绑定到磷酸化的脯氨酰前的丝氨酸或苏氨酸位点(Ser/Thr-Pro基序),催化其发生顺反异构,进而调控底物蛋白的功能、蛋白与蛋白之间的作用,以及亚细胞的定位。研究表明Pin1在人类多种恶性肿瘤中呈高表达状态,与肿瘤的增殖、血管形成、侵袭和转移有关,因此被称为肿瘤发生、发展的催化分子。进一步研究发现,Pin1在结直肠癌中也呈现过表达,并与结直肠癌的恶性程度明显相关。本研究应用RNA干扰技术进一步探讨Pin1对结肠癌SW620细胞的增殖、凋亡能力影响及作用机制。目的:1.构建Pin1基因的RNA干扰表达载体(pGenesil-1-Pin1,缩写P-shRNA)。2.观察pGenesil-1-Pin1对大肠癌SW620细胞中Pin1基因表达的抑制作用。3.探讨Pin1基因表达下降后对大肠癌SW620细胞增殖、凋亡能力的影响,以及相关基因的表达改变情况,并初步分析其可能的分子机制。方法:1.构建Pin1基因有短发夹结构的干扰表达载体pGenesil-1-Pin1(缩写P-shRNA)、对照载体pGenesil-1-CON(简写p-CON),经双酶切后,琼脂糖凝胶电泳及DNA测序进行鉴定。2.利用脂质体将重组质粒p-shRNA和p-CON分别转染入人大肠癌细胞株SW620,提取总蛋白质,应用Western blot实验技术检测其对Pin1基因蛋白表达水平的影响。3.细胞培养计数,绘制生长曲线,利用MTT实验检测SW620细胞转染p-shRNA质粒、p-CON质粒后的增殖能力,采用流式细胞术检测SW620细胞转染后的凋亡情况。4.利用细胞免疫荧光方法检测SW620细胞转染p-shRNA质粒、p-CON质粒后NF-κB/p65的核定位。Western blot技术进一步检测NF-κB/p65的核转移的量,以及凋亡相关因子Bcl-2的表达。结果:1.成功构建Pin1基因的RNA干扰表达载体;经双酶切、琼脂糖凝胶及DNA测序鉴定正确。2.利用脂质体介导重组质粒转染SW620细胞后,可以抑制Pin1蛋白质的表达。p-shRNA/SW620组Pin1蛋白的相对表达量为0.065±0.005 , p-CON/SW620组为0.34±0.027,其48h抑制率约为79.3%;统计分析表明,组间差异有统计学意义(P<0.05)。提示转染Pin1干扰质粒可以有效地抑制SW620细胞中Pin1基因的表达。3.生长曲线、MTT法、流式细胞术、实验结果表明:转染Pin1干扰质粒后SW620细胞增殖能力受到抑制,而凋亡能力增强。其实验组细胞凋亡率约为12.38%,而阴性对照组细胞凋亡率约为0.065%,进行统计分析,两组差异有统计学意义(P<0.05)。4.免疫荧光结果显示: NF-κB/p65主要在细胞核内表达,转染p-shRNA质粒后,p65的荧光表达减弱。Western blot结果表示:p65在的核转移量减少,同时细胞抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达水平下降.在干扰组、对照组、空白组p65的蛋白表达量分别为0.50±0.05、0.96±0.02、0.93±0.02; Bcl-2的蛋白表达量分别为0.13±0.016、0.39±0.023、0.38±0.026.结论:1.成功构建Pin1基因的RNA干扰质粒,并经实验证实:其在大肠癌SW620细胞中可抑制Pin1基因的表达;2. Pin1基因表达下降可以有效抑制人大肠癌SW620细胞体外恶性增殖,促进凋亡。其可能的作用机制与Pin1基因表达下降降低NF-κB/p65的核内积聚,进而影响其与下游基因的生物学作用有关,为大肠癌基因治疗提供了新的思路和方法。