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研究背景与目的：甲型流感病毒依据其致病性强弱分为高致病性或低致病性，以往爆发的H5N1，H7N9和H7N7高致病性甲流疫情，死亡率高达30%以上。而低致病力甲流病毒pdm09H1N1爆发，感染患者大部分可以自行痊愈，死亡率低于0.05%。高致病性甲流的致病机制一直是研究的热点，大量研究发现免疫系统对病毒感染的过度反应，是甲型流感病毒的主要致病机制。高致病性甲型流感病毒可以引发“细胞因子风暴”，宿主免疫微环境的改变与病毒致病性密切相关。因此，对于流感病毒感染后宿主肺部组织免疫细胞的量化有望揭示免疫系统在高致病性甲流致病机制中发挥的作用。复杂组织解卷积模型的目的就是试图利用计算方法从细胞混合物的复杂组织中量化细胞类型构成比例信息，以准确刻画复杂样本的肿瘤或免疫微环境。本研究旨在利用解卷积模型预测流感病毒感染后宿主肺部组织的免疫细胞类型及构成比例，通过比较高致病性和低致病性甲流病毒感染后宿主肺部组织的免疫细胞构成及基因组表达差异，以揭示免疫系统在高致病性甲流病毒感染中发挥的多方面作用及其参与“细胞因子风暴”的作用机制。
材料和方法：GEO数据库上下载H7N9(Anhui01)，H7N7(NL219)，H5N1(VN1203)高致病性甲流病毒和pdm09H1N1低致病性甲流病毒分别感染小鼠后第1，3和5天肺部组织Microarray原始数据，每个时间点4~5个重复。利用R的Limma包，对Microarray原始数据进行背景校正，归一化处理，获得每个样本的基因表达矩阵。然后基于25种免疫细胞特异基因表达谱，用CIBERSORT算法对上述的样本基因表达矩阵解卷积，计算每个样本中25种免疫细胞的构成比例。随后依据分化来源将25种免疫细胞合并为10种免疫细胞，用csSAM包中的csfit函数分别解析不同病毒组10种免疫细胞特异基因表达谱。最后比较高和低致病力组间基因表达情况，基于免疫细胞特异基因表达谱筛选不同致病力组间差异倍数大于2的基因为差异表达基因，并进行GO和KEGG注释分析。另外在SRA数据库下载H5N1高致病性甲流病毒和H5N8低致病性甲流病毒分别感染后第1天，第3天，第7天且每个时间点有3个重复样本的小鼠肺部组织RNA-seq测序数据验证免疫细胞构成结果。用STAR比对原始序列，htseq-count统计基因原始reads数。再基于10种免疫细胞特异基因表达谱，用CIBERSORT算法计算每个样本中10种免疫细胞的构成比例。
研究结果：在感染后期高致病性甲流病毒组中单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞比例高于低致病组，而树突状细胞、B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞比例低于低致病组。另外，在H7N9(Anhui01)、H7N7(NL219)和H5N1(VN1203)三株高致病甲流病毒感染小鼠肺部中，单核细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞高表达CCL2、CCL3或CCL7等单核细胞和巨噬细胞的趋化因子，同时高表达CSF2、CXCL1、IFNg、IL-1等炎症相关细胞因子。在H7N7(NL219)和H5N1(VN1203)高致病甲流病毒感染小鼠肺部中，CD4+T细胞中低表达CCL25、CCR6、CXCR3等特异性免疫细胞趋化因子和受体，以及IL-12、IL-2R、IL-7R等T细胞活化因子及受体，还有IL-10、IL-13、TGF-等抗炎细胞因子。
研究结论：高致病性甲流病毒感染刺激CD4+T细胞、单核细胞和CD8+T细胞高表达CCL2、CCL3、CCL7等单核细胞和巨噬细胞的趋化因子促使宿主肺部单核细胞、巨噬细胞等非特异性免疫细胞比例升高，同时高表达CSF2、CXCL1、IFNg、IL-1等炎症相关细胞因子诱发炎症反应。另外，高致病性甲流病毒相比于低致病性甲流病毒，小鼠肺部中树突状细胞比例较低，而且CD4+T细胞中CCL25、CCR6、CXCR3等特异性免疫细胞趋化因子及受体低表达，IL-12、IL-2R、IL-7R等特异性免疫细胞活化因子及受体低表达，IL-10、IL-13、TGF-等抗炎细胞因子低表达，反映CD4+T细胞介导的特异性免疫细胞趋化、活化功能及对炎症反应的负调控功能受到抑制。以上结果提示了CD4+辅助性T细胞在不同致病力甲流感染过程中对调节机体免疫和炎症反应的重要作用。
材料和方法：GEO数据库上下载H7N9(Anhui01)，H7N7(NL219)，H5N1(VN1203)高致病性甲流病毒和pdm09H1N1低致病性甲流病毒分别感染小鼠后第1，3和5天肺部组织Microarray原始数据，每个时间点4~5个重复。利用R的Limma包，对Microarray原始数据进行背景校正，归一化处理，获得每个样本的基因表达矩阵。然后基于25种免疫细胞特异基因表达谱，用CIBERSORT算法对上述的样本基因表达矩阵解卷积，计算每个样本中25种免疫细胞的构成比例。随后依据分化来源将25种免疫细胞合并为10种免疫细胞，用csSAM包中的csfit函数分别解析不同病毒组10种免疫细胞特异基因表达谱。最后比较高和低致病力组间基因表达情况，基于免疫细胞特异基因表达谱筛选不同致病力组间差异倍数大于2的基因为差异表达基因，并进行GO和KEGG注释分析。另外在SRA数据库下载H5N1高致病性甲流病毒和H5N8低致病性甲流病毒分别感染后第1天，第3天，第7天且每个时间点有3个重复样本的小鼠肺部组织RNA-seq测序数据验证免疫细胞构成结果。用STAR比对原始序列，htseq-count统计基因原始reads数。再基于10种免疫细胞特异基因表达谱，用CIBERSORT算法计算每个样本中10种免疫细胞的构成比例。
研究结果：在感染后期高致病性甲流病毒组中单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞比例高于低致病组，而树突状细胞、B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞比例低于低致病组。另外，在H7N9(Anhui01)、H7N7(NL219)和H5N1(VN1203)三株高致病甲流病毒感染小鼠肺部中，单核细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞高表达CCL2、CCL3或CCL7等单核细胞和巨噬细胞的趋化因子，同时高表达CSF2、CXCL1、IFNg、IL-1等炎症相关细胞因子。在H7N7(NL219)和H5N1(VN1203)高致病甲流病毒感染小鼠肺部中，CD4+T细胞中低表达CCL25、CCR6、CXCR3等特异性免疫细胞趋化因子和受体，以及IL-12、IL-2R、IL-7R等T细胞活化因子及受体，还有IL-10、IL-13、TGF-等抗炎细胞因子。
研究结论：高致病性甲流病毒感染刺激CD4+T细胞、单核细胞和CD8+T细胞高表达CCL2、CCL3、CCL7等单核细胞和巨噬细胞的趋化因子促使宿主肺部单核细胞、巨噬细胞等非特异性免疫细胞比例升高，同时高表达CSF2、CXCL1、IFNg、IL-1等炎症相关细胞因子诱发炎症反应。另外，高致病性甲流病毒相比于低致病性甲流病毒，小鼠肺部中树突状细胞比例较低，而且CD4+T细胞中CCL25、CCR6、CXCR3等特异性免疫细胞趋化因子及受体低表达，IL-12、IL-2R、IL-7R等特异性免疫细胞活化因子及受体低表达，IL-10、IL-13、TGF-等抗炎细胞因子低表达，反映CD4+T细胞介导的特异性免疫细胞趋化、活化功能及对炎症反应的负调控功能受到抑制。以上结果提示了CD4+辅助性T细胞在不同致病力甲流感染过程中对调节机体免疫和炎症反应的重要作用。