论文部分内容阅读
目的:以激素性骨质疏松大鼠模型为对象,探讨木豆素(Cajaninstilbene Acid,CSA)防治激素性骨质疏松症的疗效;以成骨细胞(Osteoblasts,OB)、破骨细胞(Osteocla sts,OC)为研究对象,研究木豆素防治激素性骨质疏松症的细胞学及分子生物学机制。方法:1.6月龄雌性SPF级SD大鼠45只,分为3组:空白对照组(CON组)、GIOP模型组(GIOP组)、木豆素组(CSA组)。GIOP组及CSA组大鼠予以下肢肌肉注射地塞米松注射液(1.0mg/kg),每3天注射1次。CON组用等体积的生理盐水干预。三组大鼠在干预12周后,再分别给予生理盐水、CSA腹腔注射治疗。GIOP组每天给予200μl生理盐水腹腔注射;CSA组每天给予CSA 10mg/kg 200μl腹腔注射治疗。治疗为期12周。治疗结束后,各组大鼠予以腹腔采血检测ALP,腰椎骨取材以行μCT扫描、双能X线测量骨密度、组织切片以及生物力学实验。2.培养成骨细胞、破骨细胞,分别以地塞米松和木豆素干预,观察地塞米松对成骨细胞的活力、分化、矿化功能以及促细胞凋亡作用,观察木豆素对激素干预下成骨细胞的保护作用,观察木豆素对破骨细胞骨吸收功能、分化过程的影响及相关基因、蛋白表达。结果:1.大鼠骨量:与CON组比较,GIOP组BMD、BMC均明显降低(P<0.05),且治疗组BMD、BMC均明显高于GIOP组(P<0.05),然而AREA在各组间无统计学差异。2.大鼠腰椎骨微细结构:与CON组比较,GIOP组BV/TV、Tb.N、Tb.Th、v BMD均明显降低(P<0.05),SMI及Tb.Sp明显增加(P<0.05);与GIOP组比较,CSA组BV/TV、Tb.N、Tb.Th及v BMD均显著高于GIOP组(P<0.05),SMI显著低于GIOP组(P<0.05)。此外,μCT二维图显示GIOP组较CON组骨小梁明显稀疏、不连续。三维图显示,与CON组对比,GIOP组骨质显著疏松、多孔,CSA组显著改善骨小梁数量及骨小梁形态。3.大鼠骨强度:与CON组比较,GIOP组压缩强度显著降低(P<0.05)。与GIOP组比较,CSA组的压缩强度、压缩刚度及能量吸收值明显高于GIOP组(P<0.05)。4.大鼠腰椎骨形态学:在4倍及10倍镜下,随月龄增加,GIOP组的骨质损害逐渐加重;与CON组对比,GIOP组在不同时间点骨小梁数量均显著降低,骨小梁排列紊乱、稀疏、断裂、间隙增宽。在40倍镜下,与CON组对比,GIOP组在不同时间点骨细胞数量均显著降低,且小梁表面成骨细胞、破骨细胞及髓腔干细胞稀少,髓腔内脂肪泡显著增多。与GIOP组比较,低倍镜及高倍镜下,CSA在不同时间点均可显著逆转GIOP导致的骨形态学破坏。5.大鼠血清ALP活性:与CON组比较,GIOP组ALP活性明显降低(P<0.05);CSA组显著高于GIOP组(P<0.05)。6.成骨细胞活力:DEX可明显抑制成骨细胞活力。DEX抑制成骨细胞活力有剂量依赖性,50μmol/L以上浓度DEX均明显抑制成骨细胞活性(P<0.05)。CSA对成骨细胞没有明显毒性,10μmol/L浓度以内的CSA不会明显影响成骨细胞活性(P>0.05)。在DEX干预的情况下加入CSA进行共培养,CSA浓度上升对成骨细胞活性有积极作用,2.5μmol/L浓度以上的CSA可明显提高成骨细胞的活性(P<0.05)。7.成骨细胞凋亡:使用DEX诱导成骨细胞,与CON组比较,DEX可明显诱导成骨细胞发生凋亡(P<0.05)。加入CSA后,5μmol/L以及10μmol/L浓度CSA可明显降低成骨细胞凋亡率(P<0.05)。8.成骨细胞矿化能力:对成骨细胞进行ALP染色,发现CON组、DEX组以及CSA组对ALP染色结果均无明显影响(P>0.05),经成骨细胞矿化诱导、茜素红染色,DEX组成骨矿化能力较对照组明显下降(P<0.05),CSA组较DEX组明显上升(P<0.05)。9.成骨细胞分化相关基因:与CON组比较,DEX组ALP表达有所下降,加入CSA后ALP表达水平明显上升(P<0.05)。与CON组比较,DEX组OCN表达有所下降,加入CSA后OCN表达水平明显上升(P<0.05)。与CON组比较,DEX组OPN表达有所下降,加入CSA后OPN表达水平有所上升,但不显著(P>0.05)。与CON组比较,DEX组Runx2表达有所下降,加入CSA后Runx2表达水平明显上升(P<0.05)。10.成骨细胞凋亡相关基因:在加入DEX后Caspase-3表达显著上升(P<0.05),加入5μmol/L、10μmol/L浓度CSA后表达显著下降(P<0.05)。成骨细胞凋亡相关基因Caspase-6在加入DEX后表达显著上升(P<0.05),加入不同浓度CSA后表达没有明显变化(P>0.05)。成骨细胞凋亡相关基因Caspase-7在加入DEX后表达显著上升(P<0.05),加入不同浓度CSA后表达有所下降,但没有显著差异(P>0.05)。成骨细胞凋亡相关基因Caspase-9在加入DEX后表达显著上升(P<0.05),加入5μmol/L、10μmol/L浓度CSA后表达显著下降(P<0.05)。11.破骨细胞毒性实验:使用0-10μmol/L梯度浓度CSA对破骨细胞进行细胞毒性实验,与对照组相比,吸光度没有明显变化,说明CSA对破骨细胞没有明显毒性(P>0.05)。12.破骨细胞分化实验:使用RANKL诱导破骨细胞分化时加入1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L浓度CSA共培养,发现2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L浓度CSA组分化成熟的破骨细胞数量明显下降(P<0.05)。使用RANKL诱导破骨细胞分化时,在不同时间段加入10μmol/L浓度CSA,与对照组比较,发现1-3天组与1-6天组破骨细胞分化数量明显下降(P<0.05)。13.破骨细胞肌动蛋白环:在RANKL诱导破骨细胞分化时加入CSA,可明显抑制破骨细胞肌动蛋白环形成,抑制破骨细胞核聚集(P<0.05)。14.破骨细胞骨吸收实验:将成熟的破骨细胞种植到羟基磷灰石涂层培养皿中,测量破骨细胞数量以及羟基磷灰石涂层吸收面积,发现CSA可抑制单个破骨细胞的骨吸收面积(P<0.05)。15.破骨细胞分化相关基因:在加入DEX干预后Nfatc1、C-fos、Ctsk、Acp5的表达量均明显上升,加入5μmol/L、10μmol/L浓度CSA后Ctsk、Acp5表达量明显下降(P<0.05)。加入10μmol/L浓度CSA后Nfatc1、C-fos表达量明显下降(P<0.05)。16.破骨细胞分化相关蛋白:NFATc1在培养的0d、1d两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显著升高,相比对照组,CSA组升高幅度较低,差异有显著性(P<0.05)。c-Fos在培养的0d时CSA组表达稍高但差异无显著性、在1d时两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显著升高,相比CON组,CSA组升高幅度较低,差异有显著性(P<0.05)。V-ATPase-d2在培养的0d、1d两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显著升高,相比CON组,5d时CSA组升高幅度较低,差异有显著性(P<0.05)。CTSK在培养的0d、1d两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显著升高,相比对照组,CSA组升高幅度较低,差异有显著性(P<0.05)。Intergrinβ3在培养的0d、1d两组无明显差异,在培养的3d、5d两组均显著升高,相比对照组,CSA组升高幅度较低,差异有显著性(P>0.05)。结论:激素干预大鼠,腰椎骨出现严重的骨量丢失、骨微细结构破坏、骨强度降低、血清ALP活性显著降低,与既往研究结果一致,表明GIOP动物模型构建成功。CSA的干预显著提高腰椎骨BMD、BMC、BS/TV、Tb.N、Tb.Th、v BMD,降低SMI、Tb.Sp,增强骨强度,改善骨小梁情况(数量,结构,骨微环境的成骨细胞、破骨细胞、干细胞等数量),同时对DEX导致的血清ALP活性变化起到逆转作用。成骨细胞在地塞米松干预下,细胞活性明显下降,细胞凋亡率明显上升,伴随而来的是成骨细胞矿化能力的降低,成骨细胞分化相关基因ALP、OCN、OPN、Runx2表达明显下降,细胞凋亡相关基因上升(Caspase家族基因),表明地塞米松抑制成骨细胞的细胞活力、矿化功能,有可能影响分化过程及诱导成骨细胞凋亡,这可能是激素引起骨质疏松的机制之一。在成骨细胞加入木豆素干预后,成骨细胞活力、矿化能力有所回升,成骨细胞分化相关基因ALP、OCN、OPN、Runx2表达也随之上升,且细胞凋亡减少,代表成骨细胞的细胞功能得以回复,分化成熟有可能得到促进。说明木豆素防治激素性骨质疏松的机制有可能来自木豆素保护成骨细胞免于激素的抑制作用,得以维持原有的细胞活力、分化及矿化能力,避免细胞过度凋亡。木豆素对破骨细胞无直接的细胞毒性作用,破骨细胞数量未受到明显影响,然而破骨细胞骨吸收实验中破骨细胞在木豆素干预下骨吸收能力有所下降,得知木豆素可抑制单个破骨细胞的骨吸收功能。木豆素还能抑制破骨细胞肌动蛋白环的形成,进而影响破骨细胞维持正常的形态。木豆素还能抑制破骨细胞分化相关基因及蛋白表达,阻碍破骨细胞正常的分化过程。