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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病。PRRS在全球范围内广泛传播，对世界各国尤其是我国养猪产业造成了巨大的经济损失。多年来，PRRS以及PRRSV-直是兽医学和病毒学领域的重点研究对象，但目前对于PRRS的防控并未取得实质性成效，究其原因是PRRSV具有独特而且复杂的感染机制。日前研究发现PRRSV是在宿主细胞表面必需受体蛋白CD163以及其他辅助因子的参与下，通过低pH依赖的网格蛋白介导的内吞途径入侵宿主细胞的。深入研究PRRSV入侵机制，将有助于全面理解PRRSV致病机理，为新型抗病毒药物研发、新型疫苗研制提供理论依据。
作为一种新型的入侵方式，病毒凋亡模拟在病毒入侵中发挥着重要作用。本研究围绕PRRSV利用病毒凋亡模拟入侵宿主细胞这一新机制，展开了一系列研究:
1.发现了PRRSV囊膜表面暴露有磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PtdSer)。PtdSer暴露在细胞表面，是细胞凋亡的一个显著特征，可以作为一种重要的吞噬信号。研究发现部分囊膜病毒在出芽包被囊膜时会获取宿主细胞PtdSer并暴露在自身囊膜外模拟细胞凋亡。本研究首先通过密度梯度离心(density gradient centrifugation)分别获得了纯化的PRRSV-1型和PRRSV-2型不同代表毒株。随后，利用PtdSer特异性结合蛋白annexin V和抗PtdSer单克隆抗体，分别通过流式细胞术（flow cytometry，FCM）和Dot-blot检测，证明了PRRSV病毒粒子表面存在PtdSer。这一发现证实PRRSV具有进行病毒凋亡模拟的分子基础。
2.鉴定出宿主细胞表面识别PRRSV凋亡模拟的PtdSer受体为TIM(T-cell immunoglobulin andmucin domain)家族蛋白。病毒表面暴露的PtdSer会被宿主细胞PtdSer受体识别，冈此本研究通过反转录，聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹实验(IB)筛选出在MARC-145细胞和PAMs上表达的PtdSer受体分别为TIM-1和TIM-4。随后发现敲低TIM-1/4的表达水平，抑制了PRRSVRNA的复制、N蛋白的表达、PRRSV子代病毒滴度以及PRRSV的吸附和内化，表明TIM在PRRSV入侵过程中发挥重要作用。通过Dot-blot，pulldown以及抗体封闭实验等，证明了TIM通过PtdSer直接与PRRSV结合。
3.揭示PRRSV通过TIM-1诱导巨胞饮并且利用巨胞饮作为入侵途径。病毒能够通过凋亡模拟，诱导并利用宿主自身的内吞途径完成入侵。利用dextran作为巨胞饮的指示分子，在敲低TIM-1后观察并比较细胞接毒后不同时间点对dextran的摄取:通过鬼笔环肽标记F-actin观察膜凸起，证明PRRSV通过TIM-1诱导宿主细胞产生巨胞饮。利用刚包饮特异性抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利(EIPA)、肌动蛋白动员抑制剂细胞松弛素D和拉春库林A进行抑制，PRRSV与SNX5共定位等实验，证明了巨胞饮是PRRSV入侵宿主细胞的另外一种途径。
4.证明了PRRSV利用巨胞饮入侵宿主细胞需要Rac1/Cdc42-Pak1信号通路和CD163的参与。巨胞饮需要Rho GTPases酶家族分二子及其下游效应分子Pak1或P13K等通过细胞信号转导触发。对Rac1、Cdc42、Pak1和P13K进行敲低以及使用特异性抑制剂进行抑制，通过检测dextran摄取以及PRRSV感染情况发现Rac1/Cdc42-Pak1信号通路在PRRSV诱导的巨胞饮中发挥作用。同时对PRRSV必需受体CD163在PRRSV利用巨胞饮入侵宿主细胞过程中的作用进行研究。通过IB，间接免疫荧光(IFA)及RT-qPCR等实验发现，BHK-21细胞外源表达CD163可使PRRSV在细胞中建立感染，而只表达TIM-4则不能介导病毒感染;与单独表达CD163相比，同时表达CD163和TIM-4能显著增强PRRSV感染。进一步研究发现，PRRSV感染后，CD163与巨胞饮体标志物SNX5存在共定位，表明部分CD163随PRRSV经巨胞饮进入巨胞饮体中。
综上所述，本研究发现了PRRSV表面暴露有PtdSer进行病毒凋亡模拟，阐明了PRRSV利用病毒凋亡模拟入侵宿主细胞的分子细节，包括宿主细胞表面识别PRRSV的PtdSer受体(TIM)、其介导的下游信号通路(Rac/Cdc42-Pak1)和入侵途径（巨胞饮），以及TIM与PRRSV必需受体CD163在PRRSV利用巨胞饮入侵过程中的关系。这些研究将有助于全面理解PRRSV感染和致病机制，具有重要科学意义和应用价值。
作为一种新型的入侵方式，病毒凋亡模拟在病毒入侵中发挥着重要作用。本研究围绕PRRSV利用病毒凋亡模拟入侵宿主细胞这一新机制，展开了一系列研究:
1.发现了PRRSV囊膜表面暴露有磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PtdSer)。PtdSer暴露在细胞表面，是细胞凋亡的一个显著特征，可以作为一种重要的吞噬信号。研究发现部分囊膜病毒在出芽包被囊膜时会获取宿主细胞PtdSer并暴露在自身囊膜外模拟细胞凋亡。本研究首先通过密度梯度离心(density gradient centrifugation)分别获得了纯化的PRRSV-1型和PRRSV-2型不同代表毒株。随后，利用PtdSer特异性结合蛋白annexin V和抗PtdSer单克隆抗体，分别通过流式细胞术（flow cytometry，FCM）和Dot-blot检测，证明了PRRSV病毒粒子表面存在PtdSer。这一发现证实PRRSV具有进行病毒凋亡模拟的分子基础。
2.鉴定出宿主细胞表面识别PRRSV凋亡模拟的PtdSer受体为TIM(T-cell immunoglobulin andmucin domain)家族蛋白。病毒表面暴露的PtdSer会被宿主细胞PtdSer受体识别，冈此本研究通过反转录，聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹实验(IB)筛选出在MARC-145细胞和PAMs上表达的PtdSer受体分别为TIM-1和TIM-4。随后发现敲低TIM-1/4的表达水平，抑制了PRRSVRNA的复制、N蛋白的表达、PRRSV子代病毒滴度以及PRRSV的吸附和内化，表明TIM在PRRSV入侵过程中发挥重要作用。通过Dot-blot，pulldown以及抗体封闭实验等，证明了TIM通过PtdSer直接与PRRSV结合。
3.揭示PRRSV通过TIM-1诱导巨胞饮并且利用巨胞饮作为入侵途径。病毒能够通过凋亡模拟，诱导并利用宿主自身的内吞途径完成入侵。利用dextran作为巨胞饮的指示分子，在敲低TIM-1后观察并比较细胞接毒后不同时间点对dextran的摄取:通过鬼笔环肽标记F-actin观察膜凸起，证明PRRSV通过TIM-1诱导宿主细胞产生巨胞饮。利用刚包饮特异性抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利(EIPA)、肌动蛋白动员抑制剂细胞松弛素D和拉春库林A进行抑制，PRRSV与SNX5共定位等实验，证明了巨胞饮是PRRSV入侵宿主细胞的另外一种途径。
4.证明了PRRSV利用巨胞饮入侵宿主细胞需要Rac1/Cdc42-Pak1信号通路和CD163的参与。巨胞饮需要Rho GTPases酶家族分二子及其下游效应分子Pak1或P13K等通过细胞信号转导触发。对Rac1、Cdc42、Pak1和P13K进行敲低以及使用特异性抑制剂进行抑制，通过检测dextran摄取以及PRRSV感染情况发现Rac1/Cdc42-Pak1信号通路在PRRSV诱导的巨胞饮中发挥作用。同时对PRRSV必需受体CD163在PRRSV利用巨胞饮入侵宿主细胞过程中的作用进行研究。通过IB，间接免疫荧光(IFA)及RT-qPCR等实验发现，BHK-21细胞外源表达CD163可使PRRSV在细胞中建立感染，而只表达TIM-4则不能介导病毒感染;与单独表达CD163相比，同时表达CD163和TIM-4能显著增强PRRSV感染。进一步研究发现，PRRSV感染后，CD163与巨胞饮体标志物SNX5存在共定位，表明部分CD163随PRRSV经巨胞饮进入巨胞饮体中。
综上所述，本研究发现了PRRSV表面暴露有PtdSer进行病毒凋亡模拟，阐明了PRRSV利用病毒凋亡模拟入侵宿主细胞的分子细节，包括宿主细胞表面识别PRRSV的PtdSer受体(TIM)、其介导的下游信号通路(Rac/Cdc42-Pak1)和入侵途径（巨胞饮），以及TIM与PRRSV必需受体CD163在PRRSV利用巨胞饮入侵过程中的关系。这些研究将有助于全面理解PRRSV感染和致病机制，具有重要科学意义和应用价值。