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前言 基因组稳定性的维持是通过DNA的正确复制及复制后校对、DNA修复和DNA重组而完成的。许多研究认为在维持基因组的稳定中DNA修复基因起着关键的作用。探讨人体基因在DNA修复途径中作用的研究，特别是对核苷酸切除修补途径(双链NER)、双链DNA断裂修复途径(DSBR)和单链DNA断裂修复途径(SSBR)的研究取得了重大成果。 核苷酸切除修补途径的研究最早是通过对有癌倾向的先天性着色性干皮病(XP)的研究开始的。着色性干皮病是一种少见的常染色体隐性遗传性疾病，由于紫外线损害而导致核苷酸切除修补能力减弱，从而使皮肤癌的发病率增加一千倍。目前通过对交互作用基因编码的各种修复蛋白的研究，揭示了这类疾病发病的关键。XPD(着色性干皮病因子D)是转录因子的组成部分，XPD蛋白具有单链DNA依赖ATP酶和5′-3′DNA裂解酶的活性，其通过NER途径修复由于紫外线照射而导致的DNA损伤。XRCC3(X线修复交叉互补因子3)是RAD51(放射因子51)的类似物，参与DNA双链断裂、重组的修复，主要通过DSBR途径来调节DNA的修复。研究显示XRCC3突变细胞能使个体对电离辐射的敏感性减少2～3倍，而且也能减轻人体对紫外线照射和单功能烷化剂的高度敏感性。人XRCC1(X线修复交叉互补因子1)基因编码XRCC1蛋白，通过与DNA连接酶Ⅲ、DNA多聚酶相互作用参与单链DNA断裂修复(SSBR)，在对中国仓鼠卵巢突变细胞株EM9恢复DNA修复能力的研究中进一步阐明了其参与单链DNA断裂修复途径的功能区域。 遗传性因素在乳腺癌的发病中起着重要的作用，不同基因的异常表达和突变表明乳腺癌的发生是多途径的。不同乳腺癌个体可表现出同一DNA修复基因的多态性。在体外，一些有毒物质能导致染色质破裂和细胞遗传学的紊乱，其在有乳腺癌家族史个体中的发生率是无家族史个体的几倍。目前已知可应用许多不同的途径来研究乳腺癌的遗传学改变，本研究选择3个DNA修复基因，分别代表三个不同的修复途径：核盲酸切除修补途径，双链DNA断裂修复途径和单链DNA断裂修复途径，采用单链构象多态性乃SCP）方法，检测 XPDJRCC3J 基因的多态性，探讨其潜在多态性变异是否构成乳腺癌发生的高危因素，鉴别以 DNA修复基因为基础的特殊乳腺癌易感基因型，为早期筛选高危乳腺癌人群提供一个新方法。本实验分四部分：1．XPD的多态性与乳腺癌的关系。2．XRCC3的多态性与乳腺癌的关系。3．XRCCI的多态性与乳腺癌的关系。4．XPD、XRCC3、XRCCI基因多态性组合与乳腺癌的关系。 实验材料 1．主要仪器：MJ PCR扩增仪、离心机（FISHER人琼脂糖电泳仪（GIB－CO BRL）、测序胶仪（GIBCO BRL）、胶干燥仪（BIO－RAD）、分光光度仪（BECKMAN）、电子分析天平（BIO－MD）、自控温箱（BIO－RAD）、放射性自显影仪（FISHER）、高压电源（GIBCO BRL）、自动紫外光相机（FISHER）。恒温水浴箱（FISHER）、ABI PRISM 377 DNA自动测序仪（Amer Sham）。 2．材料与试剂：RPMI培养基门 人胎牛血清（HY－CLONE）、胰酶一ED TATA（INVITRO GEGEN）、QIAAMP DNA试剂盒（QIA GEGEN）、QIAQUICK胶纯化试剂盒（Q互A GEGEN）、GOLD nq聚合酶（包括GE NE－AMP10 x PCR缓冲液，MgClz溶液）（ROCHE）上ZmM dNTP混合液（GIB－CO BRL厂超纯去离子水pIO－RAD入10％过硫酸按瞩IGMA人MDE溶液（BIO一 RAD）、”P一 dCTPTP（FISHER）、TEMED（四甲基乙烯工胺）（SIMA）、甘油（SIGMA）、琼月糖（SIGMA）、50 X TAE＼5 X TBE＼漠化乙胺（SIGMA）。上样缓冲液门IGMA火光片（KADAK人暗盒uISHER入100bpDNA分子量标准物（GIBCO BRL）、DNA Star软件（DNA Star Inc）。 实验方法 1．标本：30种乳腺癌细胞株；100例有乳腺癌高危家族史的妇女；100例无乳腺癌高危家族史的妇女；高危因素收集通过Gall－Claus BRCAPRO软件，与病人对话自动确定。 ·2· 2．细胞培养及DNA提取：细胞放置于自控COZ温箱培养。从培养瓶中吸出旧培养液，加少量胰酶，加少许新培养液使细胞重新悬浮，再按合适的稀释度重新分离细胞。当细胞数长到1－5百万时，离心收集，待提DNA。高危妇女和非高危妇女的血液用 CChell preparaion tube）试管收集，离心后取淋巴细胞，应用QIAAMP DNA试剂盒提取DNA，然后测 DNAOD（260080）值，力水稀释使DNA浓度为100 吟ul。 3．聚合酶链反应（PCRXPCR引物设计在内含子或不是编码区的序歹，DNA序列来自基因库。 XPD：在外显子23 正向 5’TCAAACATAATGTCCTACT 反向 3‘CTGCGATfAAAGGCTGTGGA XRCC3：在外显子7 正向 5’GGTCGAGTGACAGTCCAAAC 反向 3’CTACCCGCAGGAGCCGGAGG XRCC：在外显子10 正向 5’GGGCATC’I’TCACTfCTG 反向 3’CTCCAGCCThffCTGATAAG PCR反应条件为：变性：94℃10分钟；温度递减5个循环：94t 20秒，68－63℃55秒，72℃20秒；?