顺铂是一种广谱的抗肿瘤药物，对乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、头颈部癌等都有显著疗效。研究表明，顺铂是一种DNA损伤的药物，主要依赖于与DNA形成加合物，通过与DNA分子形成链内或链间交叉联接而抑制DNA的复制，从而杀死细胞。近年来，随着分子生物学、细胞生物学等学科的发展，对其分子药理学的研究取得了长足的进步，研究认为除了抑制DNA的合成和复制，顺铂对肿瘤细胞的杀伤还可以通过抑制RNA的转录、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡等方式实现。同时，大量临床实践发现，长期使用顺铂，存在严重肾功能损伤、胃肠道反应、耳毒性等不良反应，同时也会导致肿瘤耐药性，使化疗效果明显降低。目前，关于其药理作用、药毒性及长期使用导致肿瘤耐药性的具体分子机制尚不完全清楚。因此，研究施药后细胞内各蛋白分子的动态行为将有助于深入认识顺铂抗肿瘤的药理机制，为临床治疗提供可靠的实验依据，为提高其疗效、降低不良反应作出贡献。 在本研究中，基于FRET、荧光成像等先进的实验手段，我们在无损伤、活细胞生理条件下，实时、直观、可视地研究顺铂诱导细胞凋亡过程中多种可能事件，检测了Bid、Bax、cytochrome c、AIF、Caspase—3等蛋白分子在该凋亡过程中的动态行为特性，重点探讨了钙依赖性蛋白酶Calpain对顺铂诱导细胞凋亡的调控作用，主要研究结果如下： 1，Bid、Bax、cytochrome c是关键的促凋亡因子，能够触发线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。本研究中，基于FRET原理设计的荧光探针pFRET—Bid被应用于检测Bid的切割活化过程。同时，我们还利用荧光成像在亚细胞水平对Bid和Bax转位线粒体及cytochrome c释放的动力学特征进行了实时分析。结果表明：顺铂诱导Bid的切割发生在施药后4—5 h，历时120±20 min。Bid被切割活化后会发生空间易位，即从胞浆内转位到线粒体。顺铂刺激后约7.5 h，Bax被激活，从胞浆内转位到线粒体，且在40±10 min完成。在凋亡后期，可以明显检测到线粒体肿胀、cytochrome c释放。同时，对Caspase家族蛋白酶活性分析的结果表明，顺铂诱导了Caspase—9、Caspase—3的活化，但是不活化Caspase—2、Caspase—8。同时，FRET技术被应用于实时检测Caspase—3动态活化，发现其激活发生在药物刺激14 h后，30 mm内即可彻底活化。以上的研究结果表明，顺铂刺激后，Bid、Bax等蛋白的活化诱导了线粒体外膜通透性增加，从而使得线粒体功能紊乱，诱导了cytochrome c自线粒体释放，从而诱发了Caspase—9、Caspase—3的活化，细胞走向不可逆的凋亡。 2，随后，通过在活细胞内可视化分析Calpain对顺铂诱导的细胞凋亡的影响，发现Calpain对顺铂诱导的细胞凋亡起着重要的调控作用。研究结果显示：顺铂刺激后，Calpain的活化是一个早期事件，发生在经过顺铂处理后4h左右，在6h左右，活化程度达最大。用抑制剂Calpeptin、PD150606抑制Calpain的活性，可以完全抑制Bid的切割活化、Bid转位线粒体，而抑制Caspase家族蛋白酶的活化则不影响Bid的激活，说明Bid是Calpain的直接底物，Calpain介导了Bid蛋白的切割活化，而Caspase不参与此事件。更为重要的是，抑制Calpain的活性，或沉默内源性Bid的表达(使Calpain的调控靶点缺失)等处理手段使cytochrome c释放、Caspase—3活化、细胞凋亡等一系列事件得以延迟，说明在顺铂诱导细胞凋亡过程中，Calpain是关键的调控因子，它所调控的凋亡通路对顺铂的药理作用机制非常重要。 3，Calpain对多种生命活动的调节有着重大作用，比如：信号转导、增殖、分化、凋亡、坏死等。在哺乳动物中普遍存在的有两种：μ—Calpain和m—Calpain。在证明了Calpain对顺铂诱导的细胞凋亡起着重要的调控作用后，进一步的研究表明，Calpain对顺铂诱导细胞凋亡的调控主要来自μ—Calpain活化的贡献，而与m—Calpain无关。抑制内源性μ—Calpain的表达可以降低Caspase—9、Caspase—3的活性，延缓顺铂诱导的凋亡，而抑制内源性m—Calpain的表达则无此效应。同时，我们的研究还发现，在顺铂诱导的细胞凋亡过程中，AIF被切割活化，它介导了Caspase—非依赖型凋亡信号通路，与Caspase—依赖型凋亡信号通路以互为补充的方式共同诱导更为有效的细胞凋亡。而AIF的切割活化则完全依赖于μ—Calpain的活化，与m—Calpain、Caspases、Cathipsins等没有关联。进一步的研究结果揭示：线粒体内源性的μ—Calpain直接介导了AIF的切割活化。 综上所述，顺铂通过诱导Bid、Bax、cytochrome c、AIF、Caspases等促凋亡因子的活化，激活了线粒体凋亡途径，从而诱导有效的细胞凋亡。μ—Calpain介导了顺铂诱导的Caspase—依赖型与Caspase—非依赖型凋亡通路，对顺铂诱导的细胞凋亡起着关键的调控作用。