二穗短柄草的遗传转化及INDETERMINATE1基因的克隆

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INDETERMINATE1(ID1)基因是从玉米中首先发现的一个控制营养生长向生殖生长转变的基因,ID1功能缺失表现出成花转变过程推迟。同时,在其他禾本科植物水稻、高粱等植物中也发现了其同源基因,通过对玉米和水稻中同源基因的研究初步证明该类基因控制的开花,是独立于光周期开花途径之外的另一条开花途径,在控制营养生长到生殖生长的转变中发挥重要作用。水稻和玉米是典型的短日照植物,其成花转变过程不需要春化作用,而小麦是长日照植物,其开花转变需要春化作用,在小麦中是否也存在类似的成花转变分子机理目前还不清楚。如果也存在类似的机理,该信号转导途径与春化作用的关系是怎样的以及该途径功能的缺失是否能被春化作用所弥补而开花是我们关心的问题。曾经尝试在小麦中克隆该基因,但未取得成功,因此决定选择麦类作物的模式植物二穗短柄草作为研究对象,阐明其成花转变的分子机理,以指导后续实验。本文以二穗短柄草Bd21为实验材料,首先分析了Bd21的生长特性,摸索了短柄草的组培转化体系,然后在Bd21中克隆得到ID1同源基因(BdID1),对其进行了序列比对,表达特性分析,并对其功能进行了初步的鉴定;同时利用EMS对二穗短柄草种子进行了诱变,希望获得一些与开花时间有关的突变体,利用Tilling技术筛选看是否能发现BdID1基因的点突变,为进一步研究该基因的功能及作用机理奠定基础。主要研究结果如下:   1、通过观察Bd21在不同的春化和光周期处理条件下的生长反应,初步得出Bd21为典型的长日照植物,且具有弱冬性和弱休眠特性。   2、利用同源序列比对设计引物,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从二穗短柄草Bd21中克隆得到一个ID1基因,命名为BdID1。其全长1661bp,编码一个429氨基酸的蛋白质,5’和3’非编码区全长分别为140bp和231bp。序列分析发现,BdID1也具有由四个锌指元件组成的ID domain,该保守区存在典型的保守基序TRDFLG。BdID1同来源与水稻、玉米和高粱的.ID1在氨基酸水平上具有较高的同源性,同源性高达56-65%。cDNA序列与基因组序列比对后发现BdID1基因组序列内存在两个内含子。   3、半定量RT-PCR分析发现,BdID1基因在整个生长周期内都有表达,在幼叶中表达量最高,而在老叶,茎干,根,芽顶端分生组织中则表达量较低。   4、摸索了短柄草的组培流程,并尝试农杆菌介导法转化pSQ5带有GFP和潮霉素双重筛选标记的质粒载体,经紫外光照射辅助筛选阳性转基因苗。同时将BdID1构建了正义、反义和RNAi植物表达载体,采用农杆菌介导的方法,转化短柄草,经潮霉素筛选获得抗性再生植株。   5、利用EMS对二穗短柄草种子进行了诱变,M2代种子已经收获,获得了几株与开花时间有关的突变体。
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