研究背景:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种以中脑黑质致密部多巴胺能神经元细胞丢失和神经元内路易小体（主要成分为α-突触核蛋白（α-Syn））出现为特征的慢性神经退行性疾病,但其发病机制尚不完全清楚。α-Syn低聚化是帕金森病的早期病理现象,中脑神经元的脂质过氧化也是帕金森病的重要病理指标,但二者是病因还是病理结果,二者之间是否有什么关联,目前的研究还没有明确结论。本研究提出科学设想:α-Syn聚集体引发的膜磷脂多不饱和脂肪酸（PL-PUFA）的过氧化可能是多巴胺能神经元死亡的潜在原因,也是帕金森病的重要发病机制。脂质过氧化损伤参与多种疾病机制,磷脂过氧化产物大量累积会引起一种新型的细胞死亡方式——铁死亡（ferroptosis）,其主要特征为铁离子的负荷增多和大量脂质过氧化物的堆积,这些特征与临床上帕金森病患者的大脑分子生物学特征高度吻合。因此,膜磷脂过氧化引发多巴胺能神经元铁死亡可能是帕金森病的重要病理机制。在目前报道的铁死亡主要通路中,谷胱甘肽过氧化物酶GPX4是唯一能清除生物膜上脂质过氧化物的酶,对铁死亡的调控起着关键作用。据此,本课题采用（1）突变型α-SynA53T过表达的体内外模型,以探讨α-Syn诱导的膜磷脂过氧化在帕金森病发病机制中的重要作用,并采用（2）Gpx4基因脑定位敲除小鼠模型,进一步证实磷脂过氧化介导的多巴胺能神经元铁死亡的分子机制,并采用LC-MS/MS氧化脂质组学分析检测氧化型磷脂的含量和分型。本研究为帕金森病α-Syn病因说提供新的探索角度,以期为开发相关防治措施提供新的研究思路。研究方法:首先,我们采用条件过表达α-SynA53T的PC12细胞以及过表达α-SynA53T的转基因小鼠,探究α-Syn与磷脂过氧化介导的铁死亡之间的联系。体外细胞实验由盐酸多西环素（Dox）作用不同时间诱导不同程度的α-Syn表达,然后采用流式细胞术和Western blot检测脂质过氧化水平和铁死亡通路相关蛋白的表达。对自然发病（15月龄）的转基因小鼠,我们采用爬杆实验、转棒实验、catwalk来检测小鼠运动与平衡能力及步态分析,采用免疫荧光检测多巴胺能神经元指标酪氨酸羟化酶TH的表达,采用试剂盒检测中脑脂质过氧化产物MDA含量,采用Western blot检测中脑组织α-Syn和铁死亡通路相关蛋白的表达,采用q-PCR检测铁死亡通路相关基因的表达,采用LC-MS/MS氧化脂质组学分析检测氧化型磷脂含量和分型。其次,为了进一步探究α-Syn对多巴胺能神经元发生磷脂过氧化介导的铁死亡的敏感性是否有影响,我们分别对上述体内外模型给予铁死亡诱导剂干扰。对条件过表达α-SynA53T的PC12细胞给予GPX4抑制剂RSL3和System xc-抑制剂erastin,对过表达α-SynA53T的转基因小鼠给予System xc-抑制剂sorafenib。然后检测脂质过氧化物的堆积、细胞膜的损伤、α-Syn和铁死亡通路相关基因与蛋白的表达,检测小鼠的帕金森病相关行为学和多巴胺能神经元指标,以及采用LC-MS/MS氧化脂质组学分析检测氧化型磷脂含量和分型。最后我们采用负载Cre的腺相关病毒（AAV）对GPX4flox/flox小鼠进行脑定位注射,特异性敲除中脑Gpx4,以此探究中脑Gpx4缺失诱导的磷脂过氧化对多巴胺能神经元的损伤。采用爬杆实验、转棒实验、catwalk来检测小鼠行为学能力,采用免疫组化检测中脑黑质多巴胺能神经元的数目,采用检测试剂盒检测中脑MDA含量,采用Western blot和q-PCR检测中脑组织α-Syn和铁死亡通路相关蛋白和基因的表达。研究结果:Dox可诱导PC12A53T细胞条件过表达α-Syn,导致脂质过氧化物4-HNE表达增加,抗氧化酶GPX4和i PLA2β表达减少、转铁蛋白受体TFR1表达增加。自然发病（15月龄）的α-SynA53T转基因小鼠与同月龄WT小鼠相比爬杆时间明显延长,在棒时间减短,catwalk检测中的行走循环、行走步频等多个指标显示运动和协调能力严重受损,此外,还出现中脑黑质TH表达减少。铁死亡相关指标方面,转基因小鼠相比WT小鼠中脑MDA含量增加,Western blot和q PCR结果均显示GPX4和i PLA2β表达减少,TFR1表达增加,LC-MS/MS氧化脂质组学分析结果显示转基因小鼠中脑组织发生明显的磷脂过氧化,且氧化型磷脂酰胆碱（PC-ox）含量增加最为明显。以上实验结果说明过表达α-SynA53T可诱导多巴胺能神经元发生磷脂过氧化损伤和铁死亡。我们对PC12A53T细胞给予RSL3,过表达α-Syn的PC12细胞对RSL3更加敏感,表现为细胞膜损伤程度更严重,脂质过氧化物累积更多,GPX4和i PLA2β蛋白表达减少更明显。同时q-PCR结果也显示类似的结果,表明脂质过氧化导致α-Syn过表达的PC12细胞对铁死亡敏感性增加。此外,我们考察了尚未发病（8月龄）的转基因小鼠,发现未发病小鼠还没有出现运动损伤和铁死亡相关变化,但给予sorafenib处理后,能明显延长这些未发病转基因小鼠的爬杆时间,缩短其在棒时间,catwalk结果也显示步态明显受损,表明sorafenib能加速转基因小鼠出现运动和协调功能障碍。此外,给予sorafenib能明显增加未发病转基因小鼠中脑MDA,减少黑质TH表达。在铁死亡相关指标方面,给予sorafenib加速未发病转基因小鼠中脑组织的GPX4和i PLA2β表达减少,m RNA检测结果显示类似的作用。此外,LC-MS/MS氧化脂质组学分析结果也显示sorafenib明显增加转基因小鼠中脑组织内PC-ox含量。实验结果说明α-Syn与铁死亡诱导剂二者间存在协同效应,sorafenib能够增加未发病转基因小鼠磷脂过氧化水平,加速多巴胺能神经元铁死亡的发生。以上体内外实验结果提示磷脂过氧化增加α-Syn过表达多巴胺能神经元对铁死亡的敏感性。最后,我们对GPX4flox/flox小鼠进行中脑特异性敲除Gpx4,发现与对照组相比,中脑Gpx4敲除小鼠体重并未受到影响,但是其爬杆时间明显延长,转棒实验的在棒时间明显变短,catwalk结果也显示步态受损,表明其运动和协调能力下降。同时敲除中脑Gpx4导致中脑黑质TH表达明显减少,此外Gpx4-/-小鼠中脑MDA含量增加,GPX4和i PLA2β表达减少,TFR1表达增加,LC-MS/MS氧化脂质组学分析结果也显示中脑Gpx4敲除小鼠中脑组织内PC-ox增加最为明显。以上结果均显示了铁死亡的参与,说明中脑Gpx4缺失诱导的磷脂过氧化可以导致多巴胺能神经元发生铁死亡进而导致小鼠运动功能障碍。研究结论:本课题采用过表达α-SynA53T的体内外帕金森病模型以及小鼠中脑特异性的脂质过氧化模型检测多巴胺能神经元发生铁死亡的分子机制,提出α-Syn堆积导致的磷脂过氧化与其神经毒性密切相关,而对其导致的多巴胺能神经元的铁死亡的干预可能为帕金森病的治疗方案提供新的策略。