金刚藤对人肝癌SMMC-7721细胞内质网应激-自噬影响的研究

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yintao001
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目的:探讨金刚藤对人肝癌SMMC-7721细胞内质网应激-自噬的影响,揭示金刚藤抗肝癌的作用机制。方法:第一部分:将SMMC-7721细胞分为Control组、JGT-L组、JGT-M组、JGT-H组,分别给予空白血清和不同浓度(0.5g/mL、1g/mL、2g/mL)金刚藤含药血清干预48h。(1)分别于12h、24h、48h采用CCK-8法检测各组SMMC-7721细胞的存活率。(2)采用流式细胞仪检测各组SMMC-7721细胞的细胞周期。(3)采用透射电镜观察各组SMMC-7721细胞的超微结构。(4)采用q RT-PCR法检测各组SMMC-7721细胞e IF2α、ATF4 m RNA表达。(5)采用Western blot法检测各组SMMC-7721细胞PERK、p-PERK、e IF2α、ATF4、CHOP蛋白表达。第二部分:采用二硫苏糖醇(DTT)干预SMMC-721细胞24h,构建内质网应激-自噬细胞模型。SMMC-7721细胞随机分为Control组(空白含药血清)、DTT组(500μM DTT)、DTT+JGT组(500μM DTT+2g/ml金刚藤含药血清)、JGT组(2g/ml金刚藤含药血清),各组均培养12h后收集细胞。(1)采用CCK-8法检测各组SMMC-7721细胞增殖能力。(2)采用透射电镜观察各组SMMC-7721细胞的内质网及自噬体。(3)采用q RT-PCR法检测各组SMMC-7721细胞TRAF2、Beclin1m RNA的表达。结果:第一部分:(1)各组SMMC-7721细胞增殖的比较:与同一时间点的Control组比较,各浓度金刚藤药物组作用于SMMC-7721细胞12h、24 h、48h后,随着金刚藤含药血清浓度的增加,SMMC-7721细胞的存活率也依次显著下降(p均<0.05)。JGT-L组、JGT-M组、JGT-H组细胞存活率逐渐降低,组间两两相比,p均<0.05。各浓度金刚藤药物组干预SMMC-7721细胞12h、24h、48h后,其半数抑制浓度IC50分别为1.369g/L、1.007g/L、0.895g/L。(2)各组SMMC-7721细胞周期各时相细胞的比较:与Control组比较,JGT-M和JGT-H组中位于G0/G1期的细胞数量显著增多(p<0.05),JGT-H组位于S期的细胞数量显著减少(p<0.05),JGT-L和JGT-M组中位于G2/M期的细胞显著减少(p<0.05)。(3)各组SMMC-7721细胞的超微结构:Control组的细胞核呈椭圆形,细胞核膜完整,细胞质内可见内质网管腔稍扩张,粗面型质网少量脱颗粒。各浓度金刚藤药物组可见大量细胞器,细胞器密度增高,细胞核缩小,染色质变得致密,呈颗粒或者块状分布于核内及核膜内侧,偶见自噬体。其中,JGT-L组及JGT-M组细胞质内可见部分空泡,少量颗粒型内质网疏松散在细胞质内,粗面型内质网少量脱颗粒;JGT-H组细胞质内可见粗面型内质网较为整齐的排列在细胞核附近,粗面型内质网少量脱颗粒。(4)各组SMMC-7721细胞e IF2α、ATF4 m RNA表达的比较:与Control组比较,JGT-M和JGT-H组e IF2α的m RNA表达显著降低(p<0.001),JGT-H组ATF4的m RNA表达显著降低(p<0.001)。(5)各组SMMC-7721细胞PERK、p-PERK、e IF2α、ATF4、CHOP蛋白表达的比较:与Control组比较,JGT-H组p-PERK的蛋白的表达显著降低(p<0.05),各浓度金刚藤药物组e IF2α蛋白的表达显著降低(p<0.05),JGT-H组ATF4的蛋白表达显著降低(p<0.05),各组SMMC-7721细胞CHOP蛋白的表达差异无统计学意义。第二部分:(1)各组SMMC-7721细胞增殖的比较:与Control组比较,DTT、DTT+JGT、JGT组细胞增殖能力均降低(p均<0.05);与DTT组比较,DTT+JGT组细胞增殖能力升高(p<0.05),JGT组细胞增殖能力降低(p<0.05);与DTT+JGT组比较,JGT组细胞增殖能力降低(p<0.05)。(2)各组SMMC-7721细胞的内质网和自噬体:Control组SMMC-7721细胞可见内质网管腔稍扩张,粗面型内质网少量脱颗粒,细胞质内可见部分自噬体;DTT组SMMC-7721细胞内,细胞器减少,细胞质内可见大量自噬体;DTT+JGT组可见细胞的内质网管腔稍扩张,粗面型内质网脱颗粒,细胞质内可见少量自噬体,JGT组内质网管腔,扩张不明显,大部分粗面型内质网,细胞质内偶见自噬体。(3)各组SMMC-7721细胞TRAF2、Beclin1 m RNA表达的比较:与Control组比较,DTT、DTT+JGT组TRAF2、Beclin1 m RNA的表达均升高(p均<0.05),JGT组TRAF2、Beclin1 m RNA的表达均降低(p均<0.05);与DTT组比较,DTT+JGT、JGT组TRAF2、Beclin1 m RNA的表达均降低(p均<0.05);DTT+JGT组比较,JGT组TRAF2、Beclin1m RNA的表达降低(p均<0.05)。结论:金刚藤能够抑制SMMC-7721的增殖、阻滞细胞于G1期,其机制可能与其抑制内质网应激未折叠蛋白反应PERK-ATF4通路,进而抑制内质网应激-自噬有关。
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